Średniowieczny dzwonek dla trędowatych.
Trąd, przewlekła choroba ludzka o potencjalnie wyniszczających konsekwencjach neurologicznych, jest wynikiem zakażenia Mycobacterium leprae. Ten niekulturowalny patogen przeszedł rozległą ewolucję redukcyjną, a połowa jego genomu jest obecnie zajęta przez pseudogeny. Wykorzystując genomikę porównawczą wykazaliśmy, że wszystkie istniejące przypadki trądu można przypisać pojedynczemu klonowi, którego rozprzestrzenianie się na całym świecie można prześledzić na podstawie analizy bardzo rzadkich polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP). Wydaje się, że choroba powstała w Afryce Wschodniej lub na Bliskim Wschodzie i rozprzestrzeniła się wraz z kolejnymi migracjami ludzi. Europejczycy lub mieszkańcy Afryki Północnej wprowadzili trąd do Afryki Zachodniej i obu Ameryk w ciągu ostatnich 500 lat.
Genomika porównawcza umożliwia nam ustalenie solidnych relacji genealogicznych z większą precyzją niż kiedykolwiek wcześniej. Trąd (1) nęka ludzkie populacje od tysięcy lat i zastanawia naukowców od czasu zidentyfikowania jego czynnika etiologicznego, Mycobacterium leprae, przez Hansena w 1873 roku (2). Główną trudnością w pracy z M. leprae jest to, że nie można go hodować w kulturze aksenicznej, a jego czas podwojenia w tkance jest powolny, prawie 13 dni (3). Dopiero gdy odkryto, że dziewięciopasmowy pancernik, Dasypus novemcinctus, może zostać zainfekowany (4), uzyskano wystarczające ilości M. leprae do analizy biologicznej i immunologicznej. Porównanie sekwencji genomu szczepu M. leprae z Tamil Nadu w Indiach (szczep TN) z sekwencją genomu bliskiego krewnego Mycobacterium tuberculosis (5) doprowadziło do znaczącego przełomu (6). Wykazano, że M. leprae wszedł na ścieżkę ewolucji redukcyjnej, w której genom uległ zmniejszeniu i zgromadził ponad 1130 pseudogenów. Wydaje się, że jednoczesna utrata funkcji katabolicznych i oddechowych spowodowała poważne ograniczenia metaboliczne (6, 7).
Aby ustalić, czy wszystkie szczepy M. leprae przeszły podobne zdarzenia i określić poziom ich pokrewieństwa, zastosowaliśmy podejścia technologiczne, które z powodzeniem wykryły regiony polimorficzne w kompleksie M. tuberculosis (8-10). Najpierw genomowy DNA przygotowany z siedmiu różnych szczepów prątków trądu (Tabela 1) hybrydyzowano z mikromacierzami odpowiadającymi pełnemu genomowi szczepu TN, ale w tych izolatach nie odkryto żadnych dowodów na dalszą utratę genów (Rysunek S1). Po drugie, aby ustalić, czy istnieją różnice w liczbie kopii rozproszonych, powtarzalnych sekwencji podobnych do sekwencji insercyjnej, przeprowadzono ilościową PCR w celu namierzenia powtarzających się sekwencji RLEP, REPLEP, LEPREP i LEPRPT (11). Ponownie, w granicach czułości tego podejścia, nie wykryto żadnych różnic między szczepem TN a innymi izolatami (Rysunek S2).
Głównym źródłem zmienności prątków gruźlicy jest przeplatana powtarzalna jednostka prątków (MIRU), która służy jako podstawa solidnego systemu typowania, który wykorzystuje różnice w zmiennej liczbie powtórzeń tandemowych (VNTR), które tworzą ten powtarzalny element (12). W przeciwieństwie do M. tuberculosis, żadne z 20 loci MIRU w szczepie TN nie zawiera powtórzeń tandemowych elementu (11), a po zbadaniu dodatkowych szczepów nie wykryto żadnych różnic w liczbie kopii. Co więcej, 20 MIRU miało identyczną sekwencję we wszystkich siedmiu badanych szczepach (Tabela 1). Celem było także siedem innych VNTR z powtórzeniami 2–6 pz, ponieważ niektóre z nich okazały się przydatne do śledzenia szczepów na krótkich dystansach epidemiologicznych (13–16). Nie zaobserwowano żadnych zmian w powtórzeniu heksanukleotydowym umiejscowionym w sekwencji kodującej genu sigA (rpoT) (17), natomiast podczas badania dwóch powtórzeń trinukleotydowych i czterech powtórzeń dinukleotydowych, zlokalizowanych w pseudogenach lub niekodujących regionach genomu, zaobserwowano znaczne różnice w liczbie egzemplarzy (tabela 1). Jednakże, jak oczekiwano w przypadku takich sekwencji, które są bardzo podatne na nieprawidłowe sparowanie nici podczas replikacji (18), poziom zmienności był zbyt duży, aby umożliwić wykrycie wzorców.
Chociaż wyniki te wykluczają istnienie najbardziej prawdopodobnych zdarzeń insercji i delecji, dostarczają mniej informacji na temat topologii genomu i organizacji globalnej. Cechy te zbadano poprzez pobranie odcisków palców i sekwencjonowanie końców 1466 kosmidów z biblioteki drugiego indyjskiego szczepu M. leprae, co doprowadziło do zintegrowanej mapy genomu, która wykazała doskonałą współkolistość z mapą szczepu TN (19, 20). Aby zwiększyć prawdopodobieństwo wykrycia polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), wybrane geny, regiony niekodujące i pseudogeny sekwencjonowano z brazylijskiego szczepu Br4923 (Tabela S1), który został wybrany z dwóch powodów; względne oddalenie geograficzne kraju i dotkliwość obciążenia chorobami w Brazylii, która jest drugą co do wielkości na świecie po Indiach (1). W ten sposób ujawniono pięć SNP w sekwencjonowanym DNA o długości 142 kb: jeden w najwyraźniej niekodującym regionie i cztery w pseudogenach. Kiedy analizowano wszystkie siedem szczepów, tylko trzy z SNP znaleziono w dwóch lub większej liczbie badanych szczepów (Figura 1A), podczas gdy pozostałe dwa ograniczały się do szczepu TN M. leprae. Ogólnie rzecz biorąc, częstotliwość SNP obserwowana u M. leprae wynosząca ~1 na 28 kb była znacznie mniejsza niż obserwowana u innych ludzkich patogenów, takich jak prątki gruźlicy (8, 9, 21, 22), Salmonella typhi (23) i Helicobacter pylori ( 24) (Tabela 2). Podsumowując, odkrycia te wskazują, że genom M. leprae jest wyjątkowo dobrze zachowany, a prątek trądu jest wysoce klonalny (25).
Aby uzyskać wgląd w ogólnoświatową dystrybucję SNP M. leprae, poszukiwaliśmy trzech informacyjnych SNP w sumie 175 próbek klinicznych i laboratoryjnych z 21 krajów i wszystkich pięciu kontynentów. Odkryliśmy, że z możliwych 64 permutacji wystąpiły tylko cztery (tabele 3 i S2), określane jako typy SNP 1–4. Kiedy sondowano panel VNTR, stwierdzono znaczną zmienność dla sześciu VNTR (tabela S2), ale nie stwierdzono konkretnego VNTR wzór był powiązany z danym typem SNP. Natomiast istnieje korelacja między pochodzeniem geograficznym pacjenta z trądem a profilem SNP, ponieważ typ 1 występuje głównie w Azji, regionie Pacyfiku i Afryce Wschodniej, typ 4 w Afryce Zachodniej i regionie Karaibów, a typ 3 w Europie. Afryka Północna i Ameryki. SNP typu 2 jest najrzadszy i został wykryty jedynie w Etiopii, Malawi, Nepalu/północnych Indiach i Nowej Kaledonii.
Starożytne teksty opisują istnienie trądu w Chinach, Indiach i Egipcie około 600 r. p.n.e., a szczątki szkieletów noszące znamiona tej choroby zostały znalezione w Egipcie (26). Uważa się, że trąd pochodzi z subkontynentu indyjskiego i został wprowadzony do Europy przez greckich żołnierzy powracających z indyjskiej kampanii Aleksandra Wielkiego (26). Uważa się, że z Grecji choroba rozprzestrzeniła się w basenie Morza Śródziemnego, a Rzymianie wprowadzili trąd do zachodniej części Europy. Niewiele wiadomo o Afryce Subsaharyjskiej, z wyjątkiem tego, że choroba była obecna przed erą kolonialną. Uważa się, że z Indii trąd rozprzestrzenił się do Chin, a następnie do Japonii, docierając na wyspy Pacyfiku, takie jak Nowa Kaledonia, dopiero w XIX wieku.
Nasze wyniki dostarczają dowodów na ogólny schemat ewolucyjny M. leprae i, w oparciu o naszą interpretację danych SNP, oferują dwa alternatywne wnioski dotyczące globalnego rozprzestrzeniania się trądu, które różnią się od klasycznych wyjaśnień. Możliwe są dwa równie prawdopodobne scenariusze ewolucyjne (ryc. 1B, 2). W pierwszym, SNP typu 2, z Afryki Wschodniej / Azji Środkowej, poprzedzał typ 1, który migrował na wschód, oraz typ 3, który rozprzestrzenił się na zachód w populacjach ludzkich, zanim powstał typ 4. W drugim scenariuszu typ 1 był protoplastą typu 2, a typy SNP 3 i 4 następowały w tej kolejności.
Trąd został najprawdopodobniej wprowadzony do Afryki Zachodniej przez zainfekowanych odkrywców, handlarzy lub kolonialistów pochodzenia europejskiego lub północnoafrykańskiego, a nie przez migrantów z Afryki Wschodniej, ponieważ SNP typu 4 jest znacznie bliższy typowi 3 niż typowi 1 (rysunek 1B). Uważa się, że Afryka Zachodnia i Południowa zostały zasiedlone >50 000 lat temu przez migrantów z Afryki Wschodniej przed przybyciem ludzi do Eurazji (27, 28). Wydaje się mało prawdopodobne, aby wcześni ludzie przywieźli ze sobą trąd do Afryki Zachodniej, chyba że ten konkretny klon bakteryjny został później zastąpiony. Z Afryki Zachodniej trąd został następnie wprowadzony przez handel niewolnikami w XVIII wieku na wyspy Karaibskie, do Brazylii i prawdopodobnie innych części Ameryki Południowej, ponieważ izolaty M. leprae z tym samym typem SNP, 4, występują tam, jak w Afryce Zachodniej.
Szczep M. leprae odpowiedzialny za chorobę w większości Ameryk jest najbardziej zbliżony do odmiany europejskiej/północnoafrykańskiej (rysunek 1B), co wskazuje, że kolonializm i emigracja ze starego świata najprawdopodobniej przyczyniły się do wprowadzenia trądu do Nowego Świata. Na przykład w XVIII i XIX wieku, kiedy środkowo-zachodnie stany USA zostały zasiedlone przez imigrantów ze Skandynawii, odnotowano wiele przypadków trądu, a w tym czasie w Norwegii trwała poważna epidemia (26). Dalsze wsparcie dla tej hipotezy zapewnia odkrycie, że dzikie pancerniki z Luizjany w USA, które są naturalnie zakażone M. leprae, są nosicielami europejskiego/północnoafrykańskiego szczepu SNP typu 3, co wskazuje, że zostały one zakażone ze źródeł ludzkich. Podczas gdy większość prątków występuje w glebie, nie ma przekonujących dowodów na istnienie środowiskowego rezerwuaru M. leprae, a poza pancernikami, które mają ograniczony zasięg geograficzny i dopiero niedawno zostały zarażone, nie ma znanego zwierzęcego źródła patogenu. Chociaż nie można wykluczyć starożytnego pochodzenia odzwierzęcego, ukąszenia owadów mogły być również możliwą drogą wczesnej infekcji człowieka, zwłaszcza że ostatnie badania pokazują, że Mycobacterium ulcerans, pokrewny patogen z wieloma pseudogenami, wydaje się być przenoszony przez owady wodne (29).
Podsumowując, M. leprae, ze swoim wyjątkowo stabilnym genomem, jest pomocnym markerem do śledzenia migracji ludów i odtwarzania kroków, które doprowadziły do powstania współczesnych populacji ludzkich. Pod tym względem uzupełnia on H. pylori, który jest znacznie bardziej zróżnicowany, a tym samym pozwala na lepsze zrozumienie etnicznego pochodzenia ludzi (30). Warto zauważyć, że największa różnorodność typów SNP w pałeczce trądu występuje na wyspach, takich jak Francuskie Indie Zachodnie i Nowa Kaledonia (rysunek 2), odzwierciedlając przejście i zasiedlenie przez różne populacje ludzkie. Wreszcie, niezwykła klonalność obserwowana w izolatach M. leprae wskazuje, że rozpad genomu nastąpił przed globalnym rozprzestrzenianiem się trądu i że od tego czasu nie przyspieszył znacząco.
Referencje i uwagi
1. W. J. Britton, D. N. J. Lockwood, Lancet 363, 1209-1219 (2004). 2. G. H. A. Hansen, Norsk Magazin for Laegervidenskaben (supplement) 4, 1-88 (1874).
3. C. C. Shepard, D. H. McRae, J. Bacteriol. 89, 365-372 (1965).
4. W. K. Kirchheimer, E. E. Storrs, Int. J. Lep. 39, 693-702 (1971).
5. S. T. Cole et al., Nature 393, 537-544 (1998).
6. S. T. Cole et al., Nature 409, 1007-1011 (2001).
7. K. Eiglmeier et al., Lepr. Rev. 72, 387-398 (2001).
8. R. Brosch, A. S. Pym, S. V. Gordon, S. T. Cole, Trends Microbiol. 9, 452-458 (2001).
9. R. Brosch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 3684-9. (2002).
10. P. Supply et al., Molec. Microbiol. 36, 762-71, (2000).
11. S. T. Cole, P. Supply, N. Honoré, Lepr. Rev. 72, 449-461 (2001).
12. E. Mazars et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 13, 1901-6. (2001).
13. Y. C. Shin, H. Lee, G. P. Walsh, J. D. Kim, S. N. Cho, J. Clin. Microbiol. 38, 4535-8.
(2000).
14. R. W. Truman, A. B. Fontes, A. B. de Miranda, P. Suffys, T. Gillis, J. Clin. Microbiol.
42, 2558-2565 (2004).
15. N. A. Groathouse et al., J. Clin. Microbiol. 42, 1666-1672 (2004).
16. S. K. Young et al., J. Clin. Microbiol. 42, 4931-6. (2004).
17. M. Matsuoka et al., Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 68, 121-8 (2000).
18. S. T. Lovett, Molec. Microbiol. 52, 1243-1253 (2004).
19. K. Eiglmeier, S. Simon, T. Garnier, S. T. Cole, Lepr. Rev. 72, 462-469 (2001).
20. K. Eiglmeier, N. Honoré, S. A. Woods, B. Caudron, S. T. Cole, Molec. Microbiol. 7,
197-206 (1993).
21. R. D. Fleischmann et al., J. Bacteriol. 184, 5479-90. (2002).
22. T. Garnier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 7877-82 (2003).
23. C. Kidgell et al., Infect. Genet. Evol. 2, 39-45 (2002).
24. D. Falush et al., Science 299, 1582-5 (2003).
25. J. Maynard-Smith, N. H. Smith, M. O’Rourke, B. G. Spratt, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 90, 4384–8 (1993).
26. S. G. Browne, in Leprosy R. C. Hastings, Ed. (Churchill Livingstone, Edinburgh,
1985).
27. P. A. Underhill et al., Nat. Genet. 26, 358–361 (2000).
28. L. L. Cavalli-Sforza, M. W. Feldman, Nat. Genet. Supp. 33, 266–275 (2003).
29. L. Marsollier et al., Appl. Environ. Microbiol. 68, 4623-8. (2002).
30. T. Wirth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 4746-51 (2004).
31. We thank S. Brisse, R. Brosch, S.V. Gordon, R. Davies and C. Morey for their help,
advice, and encouragement, and the patients and staff of the various leprosy clinics for
their invaluable participation. The DNA sequences of SNP-containing regions have
been deposited at GenBank with accession numbers AY960580-AY960582. This
work received the financial support of the Institut Pasteur, the Association Française
Raoul Follereau, Lepra, the Consortium National de Recherche en Génomique (RNG
programme), and the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and
Infectious Diseases (grant RO1-AI47197-01A1 and contract NO1-AI25469)
Marc Monot1*, Nadine Honoré1*, Thierry Garnier1 , Romulo Araoz1 , Jean-Yves Coppée2 , Céline Lacroix2 , Samba Sow3 , John S. Spencer4 , Richard W. Truman5 , Diana L. Williams5 , Robert Gelber6 , Marcos Virmond7 , Béatrice Flageul8 , Sang-Nae Cho9 , Baohong Ji10 , Alberto Paniz-Mondolfi11 , Jacinto Convit11 , Saroj Young12 , Paul E. Fine12 , Voahangy Rasolofo13 , Patrick J. Brennan4 i Stewart T. Cole1+
1 Unité de Génétique Moléculaire Bactérienne, Institut Pasteur, Paryż, Francja
2 PF2, Génopole, Institut Pasteur, Paryż, Francja
3 Centre National d’Appuis à la Lutte Contre la Maladie, Bamako, Mali
4 Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, Colorado 80523-1682, USA
5 National Hansen’s Disease Program, DHHS/HRSA/BPHC, Lousiana State University, Baton Rouge, Lousiana 70894, USA
6 Leonard Wood Memorial Center for Leprosy Research, Cebu, Filipiny
7 Instituto „Lauro de Souza Lima”, Bauru, São Paulo, Brazylia
8 Hôpital Saint-Louis, Paryż, Francja
9 Yonsei University College of Medicine, Seul, Republika Korei
10 Bactériologie-Hygiène, Faculté de Médecine Pitié-Salpêtrière, Paryż, Francja
11 Instituto de Biomedicina, Caracas, Wenezuela
12 London School of Hygiene and Tropical Medicine, Londyn, Wielka Brytania
13 Institut Pasteur de Madagascar, Antananarivo, Madagaskar
* Ci autorzy przyczynili się w równym stopniu.
+ Do kogo należy kierować korespondencję: E-mail: stcole@pasteur.fr
Aby zacytować tę wersję: Marc Monot, Nadine Honoré, Thierry Garnier, Romulo Araoz, Jean-Yves Coppée, et al.. O pochodzeniu trądu. Science, 2005, 308 (5724), pp.1040-2. ff10.1126/science/1109759ff. ffpasteur-00204117f
Link do artykułu: https://pasteur.hal.science/pasteur-00204117/file/Monot_science.pdf
HAL to multidyscyplinarne archiwum o otwartym dostępie służące do deponowania i rozpowszechniania dokumentów z badań naukowych, niezależnie od tego, czy zostały opublikowane, czy nie. Dokumenty mogą pochodzić z instytucji dydaktycznych i badawczych we Francji lub za granicą, a także z publicznych lub prywatnych ośrodków badawczych. Wielodyscyplinarne archiwum HAL jest przeznaczone do deponowania i rozpowszechniania dokumentów naukowych z zakresu badań, opublikowanych lub nie, pochodzących z instytucji dydaktycznych i badawczych we Francji lub za granicą, laboratoriów publicznych lub prywatnych.
Rozpowszechniane na licencji Creative Commons Uznanie autorstwa – Użycie niekomercyjne – Na tych samych warunkach 4.0
Licencja międzynarodowa: O pochodzeniu trądu. Marc Monot, Nadine Honoré, Thierry Garnier, Romulo Araoz, Jean-Yves Coppée, Céline Lacroix, Samba Sow, John S. Spencer, Richard W. Truman, Diana L. Williams, et al. T
Pomocnicze materiały online
www.sciencemag.org
Materiały i metody
Rysunki S1, S2
Tabele S1, S2, S3
*, liczby odnoszą się do liczby powtórzeń w szczepie Tamil Nadu (11), podczas gdy liczby w tabeli oznaczają liczbę kopii występujących w odpowiednich izolatach. IP, Instytut Pasteura; NHDP, Narodowy Program Choroby Hansena; CSU, Uniwersytet Stanowy Kolorado.
Rysunek 1. Analiza SNP izolatów o różnym pochodzeniu geograficznym i parsymonia. A. Porównanie miejsc polimorficznych w genomach szczepów TN i Br4923 za pomocą automatycznego sekwencjonowania DNA. Współrzędne oznaczają pozycję w genomie szczepu TN, a pionowy pasek wskazuje polimorficzną bazę. B. Najbardziej uproszczona ścieżka wyjaśniająca cztery typy SNP. Pogrubione strzałki wskazują najbardziej prawdopodobny kierunek, w oparciu o względy historyczne i geograficzne, podczas gdy słaba strzałka oznacza alternatywną trasę.
