Starożytne DNA z chalkolitycznego Izraela ujawnia rolę mieszanki populacji w transformacji kulturowej / Harney, É., May, H., Shalem, D. i in.

Kultura materialna późnego chalkolitu w południowym Lewancie kontrastuje jakościowo z kulturą z wcześniejszych i późniejszych okresów w tym samym regionie. Późny chalkolit w Lewancie charakteryzuje się wzrostem gęstości osadnictwa, wprowadzeniem sanktuariów ^{1 , 2 , 3} , wykorzystaniem ossuariów w pochówkach wtórnych ^4 , 5 , a także ekspansją publicznych praktyk rytualnych oraz rozkwitem motywów symbolicznych rzeźbionych i malowane na artefaktach z ceramiki, bazaltu, miedzi i kości słoniowej ^{6 , 7 , 8 , 9}. Imponujące metalowe artefakty z tego okresu, które odzwierciedlają pierwsze znane zastosowanie techniki „traconego wosku” do odlewania miedzi, świadczą o niezwykłych umiejętnościach technicznych ludzi tego okresu ^10 , 11 .

Charakterystyczne cechy kulturowe późnego chalkolitu w Lewancie (często związane z kulturą Ghassulian, chociaż termin ten w praktyce nie jest stosowany w regionie Galilei, w którym opiera się niniejsza praca) mają niewiele stylistycznych powiązań z wcześniejszymi lub późniejszymi kulturami materialnymi regionu, co doprowadziło do szeroko zakrojonej debaty na temat pochodzenia ludzi, którzy stworzyli tę kulturę materialną. Jedna z hipotez głosi, że kultura chalkolitu w regionie została częściowo rozprzestrzeniona przez imigrantów z północy (tj. z północnej Mezopotamii), w oparciu o podobieństwa w projektach artystycznych ^12 , 13. Inni sugerowali, że lokalna ludność Lewantu była całkowicie odpowiedzialna za rozwój tej kultury i że wszelkie podobieństwa do kultur materialnych na północy wynikają z zapożyczania idei, a nie z przemieszczania się ludzi ^{2 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19}.

Aby zbadać te pytania, zbadaliśmy starożytne DNA ze stanowiska chalkolitycznego w północnym Izraelu, Peqi’in (ryc.  1a ). Ta jaskinia, która ma około 17 m długości i 4,5–8,0 m szerokości (ryc.  1b ), została odkryta podczas budowy drogi w 1995 r. I została uszczelniona przez naturalne procesy podczas lub pod koniec późnego okresu chalkolitu (około 3900 pne) . Wykopaliska archeologiczne ujawniły niezwykłą gamę misternie wykonanych przedmiotów, w tym kielichy, misy i maselnice, a także ponad 200 ossuariów i dzbanów domowych, które zostały przekształcone w ossuaria (największa liczba, jaką kiedykolwiek znaleziono w jednej jaskini), często ozdobione antropomorficznymi wzorami (Rys.  1c ) ^20 , 21. Oszacowano, że jaskinia grobowa zawierała do 600 osobników ²² , co czyni ją największym miejscem pochówku, jakie kiedykolwiek zidentyfikowano z okresu późnego chalkolitu w Lewancie. Bezpośrednie datowanie radiowęglowe sugeruje, że jaskinia była używana przez cały późny chalkolit (4500-3900 pne), funkcjonując jako centralne miejsce pochówku w regionie ^21 , 23.

Tło witryny. a Lokalizacja miejsca, w którym znajduje się jaskinia Peqi’in. b Zdjęcie wnętrza jaskini Peqi’in. Zdjęcie Hila May, dzięki uprzejmości Centrum Ewolucji Człowieka i Biohistorii im. Dana Davida. c Zdjęcie kilku urn grobowych (ossuariów) z jaskini Peqi’in. Pasek skali: 10 cm. Zdjęcie Mariana Salzberger, dzięki uprzejmości Israel Antiquities Authority. Ta liczba nie jest objęta licencją CC BY dla tego artykułu. Wszelkie prawa zastrzeżone.

Wcześniejsze badania starożytnego DNA obejmujące cały genom z Bliskiego Wschodu ujawniły, że w czasie, gdy rozwijało się rolnictwo, populacje z Anatolii, Iranu i Lewantu były mniej więcej tak samo zróżnicowane genetycznie, jak dzisiejsi Europejczycy i mieszkańcy Azji Wschodniej ^24 , 25. Jednak w epoce brązu ekspansja różnych bliskowschodnich populacji rolniczych — anatolijskich, irańskich i lewantyńskich — we wszystkich kierunkach i wzajemne mieszanie się zasadniczo ujednoliciła populacje w całym regionie, przyczyniając się w ten sposób do stosunkowo niskiego zróżnicowania genetycznego, które dominuje dzisiaj ²⁴ . Lazaridis i in.²⁴wykazało, że populacja Lewantu z epoki brązu z miejsca „Ain Ghazal w Jordanii (2490–2300 pne) może być statystycznie dopasowana jako mieszanka około 56% pochodzenia z grupy spokrewnionej z rolnikami z neolitu lewantyńskiego przed ceramiką (reprezentowane przez starożytne DNA z Motza w Izraelu i „Ain Ghazal w Jordanii; 8300–6700 pne) i 44% związanych z populacjami irańskiego chalkolitu (Seh Gabi, Iran; 4680–3662 kal. p.n.e.). Haber i in. ²⁶zasugerował, że populacja kananejskiego Lewantu z epoki brązu z miejsca Sydonu w Libanie (~ 1700 p.n.e.) może być modelowana jako mieszanka tych samych dwóch grup, aczkolwiek w różnych proporcjach (48% związanych z neolitem Lewantu i 52% z irańskim chalkolitem) . Jednak dotychczas przeanalizowane stanowiska z epoki neolitu i epoki brązu w Lewancie są oddalone w czasie o ponad trzy tysiące lat, co sprawia, że ​​badanie próbek wypełniających tę lukę, takich jak te z Peqi’in, ma kluczowe znaczenie.

W specjalnym pomieszczeniu czystym w Harvard Medical School uzyskaliśmy proszek kostny z 48 szczątków szkieletowych, z których 37 to kości skaliste znane z doskonałego zachowania DNA ²⁷ . Wyekstrahowaliśmy DNA ²⁸ i zbudowaliśmy biblioteki sekwencjonowania nowej generacji, do których dołączyliśmy unikalne kody kreskowe, aby zminimalizować możliwość zanieczyszczenia. Biblioteki potraktowaliśmy glikozylazą uracylowo-DNA (UDG), aby zredukować charakterystyczne starożytne uszkodzenia DNA, z wyjątkiem pierwszego i ostatniego nukleotydu ²⁹ (tabela uzupełniająca  1 i dane uzupełniające  1zapewnić tło dla udanych próbek i podać informacje odpowiednio dla każdej biblioteki). Po wstępnym skriningu poprzez wzbogacenie bibliotek pod kątem mitochondrialnego DNA, wzbogaciliśmy obiecujące biblioteki o sekwencje pokrywające się z około 1,2 milionami polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) ^30 , 31. Oceniliśmy każdą osobę pod kątem autentyczności starożytnego DNA, ograniczając się do bibliotek z minimum 3% błędami cytozyny do tyminy na końcowym nukleotydzie 29, wymagając, aby stosunek sekwencji chromosomu X do Y był charakterystyczny dla obu samca lub samicę, wymagając >95% dopasowania do sekwencji konsensusowej mitochondrialnego DNA ³⁰oraz wymagając (w przypadku samców) braku zmienności w znanych pozycjach polimorficznych na chromosomie X (szacunki punktowe zanieczyszczenia poniżej 2%) ³² . Ograniczyliśmy się również do osób, które przynajmniej raz objęły co najmniej 5000 docelowych SNP.

Ta procedura dała dane dotyczące całego genomu od 22 starożytnych osobników z jaskini Peqi’in (4500–3900 calBCE), przy czym osoby miały medianę 358 313 docelowych SNP objętych co najmniej raz (zakres: 25 171–1 002 682). Zbiór danych jest wyjątkowej jakości, biorąc pod uwagę zazwyczaj słabe zachowanie DNA na ciepłym Bliskim Wschodzie, z wyższym odsetkiem próbek dających znaczne pokrycie starożytnego DNA niż wcześniej uzyskano z regionu, prawdopodobnie odzwierciedlając zastosowane przez nas optymalne techniki pobierania próbek i dobre warunki konserwatorskie w jaskini. Przeanalizowaliśmy ten zestaw danych w połączeniu z wcześniej opublikowanymi zbiorami danych starożytnych populacji Bliskiego Wschodu ^24 , 26 rzucić światło na historię osób pochowanych w jaskini Peqi’in oraz na dynamikę populacji Lewantu w okresie późnego chalkolitu.

Zróżnicowanie i różnorodność genetyczna w starożytnym Lewancie

W sumie 20 próbek Peqi’in wydaje się być niezwiązanych ze sobą w granicach naszej rozdzielczości (to znaczy analiza genetyczna sugeruje, że nie były one krewnymi pierwszego, drugiego ani trzeciego stopnia) i wykorzystaliśmy je jako nasz zestaw analiz. Korzystając z nowego punktu danych dodanego przez próbki Peqi’in, zaczęliśmy od zbadania, jak zróżnicowanie genetyczne między populacjami lewantyńskimi zmieniało się w czasie. Powtórzyliśmy poprzednie doniesienia o dramatycznym spadku zróżnicowania genetycznego w czasie w Zachodniej Eurazji ²⁴ , obserwując medianę parami F _ST wynoszącą 0, 023 (zakres: 0, 009–0, 061) między próbkami Peqi’in (skrót: Levant_ChL) a innymi zachodnio-euroazjatyckimi neolitami i chalkolitami populacji, w stosunku do wcześniej podanej mediany parami F _ST0,098 (zakres: 0,023–0,153) obserwowany między populacjami w okresach przedneolitycznych, 0,015 (zakres: 0,002–0,045) w okresach epoki brązu i 0,011 (zakres: 0–0,046) we współczesnych populacjach zachodniej Eurazji ²⁴ . Tak więc upadek do obecnych poziomów zróżnicowania został w dużej mierze zakończony przez chalkolit (rysunek uzupełniający  1 ).

Obserwujemy również wzrost różnorodności genetycznej w czasie w Lewancie, mierzony szybkością polimorfizmu między dwiema losowymi sekwencjami genomu w każdym SNP analizowanym w naszym badaniu. Konkretnie, populacja Levant_ChL wykazuje pośredni poziom heterozygotyczności względem wcześniejszych i późniejszych populacji (Fig.  2 ).

Różnorodność genetyczna w starożytnym Lewancie. Z biegiem czasu heterozygotyczność wzrasta w starożytnych populacjach lewantyńskich. Podano szacunkową statystykę ± 3 błędy standardowe.

Zarówno rosnąca różnorodność genetyczna w czasie, jak i zmniejszone zróżnicowanie między populacjami mierzone za pomocą F _ST są zgodne z modelem, w którym przepływ genów zmniejszał zróżnicowanie między grupami, jednocześnie zwiększając różnorodność w obrębie grup.

Genetyczne podobieństwa osobników z jaskini Peqi’in

Aby uzyskać jakościowy obraz tego, jak te osoby odnoszą się do wcześniej opublikowanego starożytnego DNA i do współczesnych ludzi, zaczęliśmy od przeprowadzenia analizy głównych składowych (PCA) ³³ . Na wykresie pierwszej i drugiej składowej głównej (ryc.  3a), próbki z jaskini Peqi’in tworzą ciasne skupisko, wspierając grupowanie tych osobników w pojedynczą populację do analizy (chociaż używamy szerokiej nazwy „Levant_ChL” w odniesieniu do tych próbek, zdajemy sobie sprawę, że są one obecnie jedynymi starożytnymi DNA dostępne z Lewantu w tym okresie i przyszłe prace prawdopodobnie ujawnią podstrukturę genetyczną w próbkach chalkolitu w szerokim regionie). Klaster Levant_ChL pokrywa się w PCA z klastrem zawierającym neolityczne próbki lewantyńskie (Levant_N), chociaż jest nieco przesunięty w górę na wykresie w kierunku klastra odpowiadającego próbkom z epoki brązu Lewantu, w tym próbkom z „Ain Ghazal, Jordania (Levant_BA_South) i Sydon w Libanie (Levant_BA_North).²⁴ .

Struktura genetyczna analizowanych osobników. a Analiza głównych składowych 984 współczesnych mieszkańców Zachodniej Eurazji (pokazana na szaro) z 306 starożytnymi próbkami rzutowanymi na pierwsze dwie główne osie składowe i oznaczonymi według kultury. b Analiza DOMIESZANKI 984 i 306 starożytnych próbek z K  = 11 składników przodków. Pokazane są tylko starożytne próbki

Analiza skupień oparta na modelu ADMIXTURE34 przyniosła wyniki zgodne z PCA, sugerując, że osobnicy z populacji Levant_ChL mieli średnio większe pokrewieństwo z irańskimi populacjami związanymi z rolnictwem niż miało to miejsce w przypadku wcześniejszych osobników lewantyńskich. Rysunek 3b pokazuje wyniki ADMIXTURE dla starożytnych osobników przy założeniu K = 11 klastrów (wybraliśmy tę liczbę, ponieważ maksymalizuje ona komponenty rodowe, które są skorelowane ze starożytnymi populacjami z Lewantu, z Iranu i europejskimi łowcami-zbieraczami)24. Podobnie jak w przypadku wszystkich populacji lewantyńskich, główny komponent rodowy przypisany do populacji Levant_ChL, pokazany na niebiesko, jest maksymalizowany u wcześniejszych osobników Levant_N i Natufian. ADMIXTURE przypisuje również składnik rodowodu w Levant_ChL, pokazany na zielono, do populacji, która jest ogólnie nieobecna we wcześniejszych populacjach Levant_N i Natufian, ale jest obecna w późniejszych próbkach Levant_BA_South i Levant_BA_North. Ten zielony komponent jest również wnioskowany w niewielkich proporcjach w kilku próbkach przypisanych do Levant_N, ale nie ma wyraźnego związku z lokalizacją archeologiczną lub datą, a osobniki te nie różnią się znacząco genetycznie od innych osobników włączonych do Levant_N przez formalne testy, a zatem łączymy wszystkie Levant_N dla głównych analiz w tym badaniu (Dodatkowa uwaga 1)24.

Ciągłość populacji i domieszki w Lewancie

Aby określić związek populacji Levant_ChL z innymi starożytnymi populacjami bliskowschodnimi, użyliśmy f-statystyki35 (więcej szczegółów w Supplementary Note 2). Najpierw oceniliśmy, czy populacja Levant_ChL jest zgodna z pochodzeniem bezpośrednio z populacji związanej z wcześniejszym Levant_N. Gdyby tak było, oczekiwalibyśmy, że populacja Levant_N byłaby zgodna z byciem bliżej spokrewnioną z populacją Levant_ChL niż z jakąkolwiek inną populacją, i rzeczywiście potwierdzamy to, obserwując dodatnią statystykę w postaci f4 (Levant_ChL, A; Levant_N, Chimpanzee) dla wszystkich starożytnych populacji testowych, A (ryc. 4a). Jednakże populacje Levant_ChL i Levant_N nie tworzą kladu, ponieważ gdy obliczamy statystykę symetrii formy f4 (Levant_N, Levant_ChL; A, Chimpanzee), stwierdzamy, że statystyka ta jest często ujemna, przy czym populacje bliskowschodnie spoza Lewantu dzielą więcej alleli z Levant_ChL niż z Levant_N (ryc. 4b). Wnioskujemy, że podczas gdy populacje Levant_N i Levant_ChL są wyraźnie spokrewnione, populacja Levant_ChL nie może być modelowana jako pochodząca bezpośrednio z populacji Levant_N bez dodatkowej domieszki związanej ze starożytnymi irańskimi rolnikami. Bezpośrednie dowody na to, że Levant_ChL jest domieszką pochodzą ze statystyki f3 (Levant_ChL; Levant_N, A), która dla niektórych populacji, A, jest znacząco ujemna, wskazując, że częstotliwości alleli w Levant_ChL mają tendencję do bycia pośrednimi między tymi w Levant_N i A – wzór, który może powstać tylko wtedy, gdy Levant_ChL jest produktem domieszki między grupami spokrewnionymi, być może daleko, z Levant_N i A35. Najbardziej negatywne statystyki f3- i f4 powstają, gdy A jest populacją z Iranu lub Kaukazu. Sugeruje to, że populacja Levant_ChL wywodzi się z populacji spokrewnionej z Levant_N, ale posiada również przodków z nielewantyńskich populacji spokrewnionych z tymi z Iranu lub Kaukazu, z którymi Levant_N nie dzieli się (lub przynajmniej dzieli się w takim samym stopniu).

Charakterystyka genetyczna Levant_ChL. a Statystyka f4(Levant_ChL, A; Levant_N, Chimpanzee) pokazuje bliskie pokrewieństwo między neolitycznymi i chalkolitycznymi populacjami Lewantu, ponieważ neolit lewantyński dzieli więcej alleli z chalkolitycznym Lewantem niż z jakąkolwiek inną populacją. b Statystyka f4(Levant_N, Levant_ChL; A, szympans) pokazuje asymetryczną relację między Levant_N i Levant_ChL a innymi starożytnymi populacjami zachodnioeuropejskimi. Statystyka jest najbardziej ujemna dla populacji z Iranu i Kaukazu, wskazując, że Levant_ChL dzieli z nimi więcej alleli niż Levant_N. c Statystyka f3(Levant_ChL; Levant_N, A) testuje sygnały domieszki w Levant_ChL. Ujemna statystyka f3 wskazuje, że populacja Levant_ChL jest domieszkowana. Populacje z Iranu i Kaukazu dają najwięcej ujemnych statystyk. Szacowana statystyka ± 3 błędy standardowe jest wskazana

Przodkowie ludu chalkolitu z Lewantu

Użyliśmy qpAdm jako naszego głównego narzędzia do identyfikacji wiarygodnych modeli domieszek dla starożytnych populacji, dla których mamy dane (więcej informacji znajduje się w uwadze dodatkowej 3 ) ³⁶ .

Metoda qpAdm ocenia, czy badany zbiór N „lewych” populacji — w tym populacja „docelowa” (populacja, której pochodzenie jest modelowane) oraz zbiór N  − 1 dodatkowych populacji — jest zgodny z otrzymanymi z mieszanin w różnych proporcjach z N  - 1 populacji przodków spokrewnionych w różny sposób ze zbiorem populacji obcych, określanych jako populacje „prawe”. We wszystkich naszych analizach używamy podstawowego zestawu 11 „prawicowych” grup zewnętrznych określanych zbiorczo jako „09NW” – Ust_Ishim, Kostenki14, MA1, Han, Papuan, Onge, Czukczi, Karitiana, Mbuti, Natufian i WHG – których wartość dla rozplątywanie rozbieżnych szczepów przodków obecnych u starożytnych mieszkańców Bliskiego Wschodu zostało udokumentowane w Lazaridis i in. ²⁴(dla niektórych analiz uzupełniamy ten zbiór o dodatkowe grupy obce). Aby ocenić, czy populacje „lewe” są zgodne z hipotezą wyprowadzenia z N  − 1 źródeł, qpAdm efektywnie oblicza wszystkie możliwe statystyki postaci f ₄ (Left _i , Left _j ; Right _k , Right _l ), ​​dla wszystkich możliwych pary populacji w proponowanych zbiorach „Lewy” i „Prawy ” . Następnie określa, czy wszystkie statystyki można zapisać jako liniową kombinację statystyk f ₄ odpowiadających wzorcom różnicowania między proponowanymi N − 1 populacji przodków, odpowiednio uwzględniając kowariancję tych statystyk i obliczając pojedynczą wartość p dla dopasowania na podstawie rozkładu T -kwadrat Hotellinga ³⁶ . Dla modeli, które są zgodne z danymi ( p  > 0,05), qpAdm szacuje proporcje domieszki dla populacji docelowej ze źródeł związanych z populacjami przodków N  − 1 (z błędami standardowymi). Co najważniejsze, qpAdm nie wymaga określania jawnego modelu, w jaki sposób populacje „prawej” grupy zewnętrznej są powiązane.

Najpierw zbadaliśmy wszystkie możliwe zestawy populacji „lewicowych”, które składały się z Levant_ChL wraz z jedną inną starożytną populacją ze zbioru danych analizy. Testując szeroki zakres starożytnych populacji, stwierdziliśmy, że wartości p dla wszystkich możliwych populacji lewicowych były poniżej 0, 05 (dane uzupełniające  2), pokazując, że Levant_ChL nie jest zgodny z byciem kladem z którymkolwiek z nich w stosunku do „prawej” grupy zewnętrznej 09NW. Następnie rozważyliśmy modele z „lewicowymi” zestawami populacji zawierającymi Levant_ChL wraz z dwiema dodatkowymi starożytnymi populacjami, co odpowiada modelowaniu Levant_ChL w wyniku dwukierunkowej domieszki między populacjami związanymi z tymi dwoma innymi starożytnymi populacjami. Aby zmniejszyć liczbę testowanych hipotez, ograniczyliśmy modele do par populacji źródłowych, które zawierają co najmniej jedną z sześciu populacji, które uważamy za najbardziej prawdopodobne źródła domieszek w oparciu o bliskość geograficzną i czasową: Anatolia_N, Anatolia_ChL, Armenia_ChL, Iran_ChL , Iran_N i Lewant_N. Ponownie, nie znajdujemy wiarygodnych dwukierunkowych modeli domieszek przy użyciu progu p  > 0, 05 (rysunek uzupełniający 2 i dane uzupełniające 3 ). Na koniec przetestowaliśmy możliwe trójdrożne zdarzenia domieszkowe, ograniczając się do trojaczków, które zawierają co najmniej dwa z sześciu najbardziej prawdopodobnych źródeł domieszek. Prawdopodobne rozwiązania przy p  > 0, 05 wymieniono w Tabeli  1 (pełne wyniki przedstawiono na Rycinie uzupełniającej  3 i Danych uzupełniających  4 ).

Znaleźliśmy wielu kandydatów do trójdrożnych modeli domieszek, zawsze obejmujących (1) Levant_N (2) Anatolia_N lub Europe_EN oraz (3) Iran_ChL, Iran_N, Iran_LN, Iran_HotuIIIb lub Levant_BA_North. Są to wszystkie bardzo podobne modele, ponieważ Europe_EN (pierwsi europejscy rolnicy) są genetycznie wywodzący się głównie od anatolijskich rolników (Anatolia_N) ³¹ , a Levant_BA_North ma przodków spokrewnionych z Levant_N i Iran_ChL ²⁶. Aby rozróżnić modele obejmujące anatolijski neolit ​​(Anatolia_N) i europejski wczesny neolit ​​(Europe_EN), powtórzyliśmy analizę, włączając dodatkowe populacje z grupy zewnętrznej w zestawie „Prawy”, które są wrażliwe na europejską domieszkę związaną z łowcami-zbieraczami obecną w większym stopniu w Europe_EN niż w Anatolia_N (rysunek uzupełniający  4a ) ³¹ (w ten sposób dodaliśmy Switzerland_HG, SHG, EHG, Iberia_BA, Steppe_Eneolithic, Europe_MNChL, Europe_LNBA do „prawych” grup zewnętrznych; skróty w tabeli uzupełniającej  2 ). Stwierdziliśmy, że tylko modele obejmujące Levant_N, Anatolia_N i Iran_ChL lub Levant_BA_North przeszły przy p  > 0, 05 (Tabela  1). Aby rozróżnić Iran_ChL i Levant_BA_North, dodaliśmy Iran_N do zestawu grup zewnętrznych (w sumie 19 = 11 + 8 grup zewnętrznych) (Rysunek dodatkowy  4b ). Tylko model z udziałem Iran_ChL pozostał wiarygodny. Na podstawie tego wyjątkowo dopasowanego modelu qpAdm wnioskujemy, że pochodzenie Levant_ChL jest wynikiem trójstronnej domieszki populacji związanych z Levant_N (57%), Iran_ChL (17%) i Anatolia_N (26%).

Pochodzenie populacji późnej lewantyńskiej epoki brązu

Uderzyło nas, że wcześniej opublikowane próbki lewantyńskie z epoki brązu z miejsc „Ain Ghazal w dzisiejszej Jordanii (Levant_BA_South) i Sidon w dzisiejszym Libanie (Levant_BA_North) można modelować jako domieszki dwukierunkowe, bez wkładu Anatolia_N co jest wymagane do modelowania populacji Levant_ChL ^24 , 26 . Sugeruje to, że populacja Levant_ChL może nie być bezpośrednio przodkiem tych późniejszych populacji lewantyńskich z epoki brązu, ponieważ gdyby tak było, spodziewalibyśmy się również wykrycia składnika pochodzenia Anatolia_N. Poniżej traktujemy Levant_BA_South i Levant_BA_North jako oddzielne populacje do analizy, ponieważ statystyka symetrii f ₄(Levant_BA_North, Levant_BA_South; A, szympans) jest istotny dla liczby populacji testowych A (| Z | ≥ 3) (dane uzupełniające  5 ), zgodnie z różnymi szacunkowymi proporcjami przodków Levant_N i Iran_ChL zgłoszonymi w ^24 , 26 .

Aby przetestować hipotezę, że Levant_ChL może być bezpośrednio przodkiem populacji lewantyńskiej epoki brązu, próbowaliśmy modelować zarówno Levant_BA_South, jak i Levant_BA_North jako dwukierunkowe domieszki między Levant_ChL i każdą inną starożytną populacją w naszym zbiorze danych, używając podstawowego zestawu populacji 09NW jako „Prawe” grupy zewnętrzne. Porównaliśmy również te modele z wcześniej opublikowanymi modelami, które wykorzystywały populacje Levant_N i Iran_ChL jako źródła (Tabela  2 ; Rysunek uzupełniający  5 ; Dane uzupełniające  6). W przypadku Levant_BA_South z Ain Ghazal w Jordanii wiele modeli było wiarygodnych, dlatego powróciliśmy do strategii dodawania dodatkowych „prawicowych” grup zewnętrznych, które są różnie spokrewnione z jedną lub kilkoma populacjami „lewicowymi” (konkretnie my dodano różne kombinacje Armenia_EBA, Steppe_EMBA, Switzerland_HG, Iran_LN i Iran_N). Tylko model obejmujący Levant_N i Iran_ChL pozostaje wiarygodny we wszystkich warunkach. Możemy zatem stwierdzić, że grupy związane z Levant_ChL wniosły niewielki wkład w pochodzenie Levant_BA_South.

Obserwujemy jakościowo odmienny wzorzec w próbkach Levant_BA_North z Sydonu w Libanie, gdzie modele obejmujące Levant_ChL w połączeniu z populacjami Iran_N, Iran_LN lub Iran_HotuIIIb wydają się być znacznie lepiej dopasowane niż modele obejmujące Levant_N + Iran_ChL. W dużej mierze potwierdzamy ten wynik, stosując „prawe” grupy zewnętrzne populacji zdefiniowane w Haber et al. ²⁶ (skr. Haber: Ust_Ishim, Kostenki14, MA1, Han, Papuan, Ami, Chuckhi, Karitiana, Mbuti, Switzerland_HG, EHG, WHG i CHG), chociaż stwierdzamy, że konkretny model obejmujący Iran_HotuIIIb nie działa już z tym „Prawym ” zbiór populacji. Badając to dalej, stwierdzamy, że dodanie Anatolia_N do zestawu „prawej” grupy zewnętrznej wyklucza model Levant_N + Iran_ChL preferowany przez Habera i in. ²⁶. Wyniki te sugerują, że populacja, która miała przodków bliżej spokrewnionych z Levant_ChL niż z Levant_N, przyczyniła się do populacji Levant_BA_North, nawet jeśli nie przyczyniła się w sposób wykrywalny do populacji Levant_BA_South.

Uzyskaliśmy dodatkowy wgląd, uruchamiając qpAdm z Levant_BA_South jako cel dwukierunkowej domieszki między Levant_N i Iran_ChL, ale teraz dodając Levant_ChL i Anatolia_N do podstawowego zestawu 09NW „Right ” 11 grup zewnętrznych. Dodanie Levant_ChL powoduje niepowodzenie modelu, co wskazuje, że Levant_BA_South i Levant_ChL mają wspólne pochodzenie po oddzieleniu ich obu od przodków Levant_N i Iran_ChL. Tak więc w przeszłości istniała niespróbowana populacja, która przyczyniła się zarówno do Levant_ChL, jak i do Levant_BA_South, mimo że Levant_ChL nie może być bezpośrednim przodkiem Levant_BA_South, ponieważ, jak opisano powyżej, ma pochodzenie związane z Anatolią_N, którego nie ma w Levant_BA_South.

Heterogeniczność genetyczna w lewantyńskiej epoce brązu

Obawialiśmy się, że nasze odkrycie, że populacja Levant_ChL była mieszanką co najmniej trzech grup, może być artefaktem braku dostępu do próbek blisko spokrewnionych z prawdziwymi populacjami przodków. Jedną z konkretnych możliwości, które rozważaliśmy, jest to, że pojedyncza populacja przodków została zmieszana z Lewantem, aby przyczynić się zarówno do populacji Levant_ChL, jak i Levant_BA_South, i że była to populacja bez próby na klinie domieszek między Anatolią_N i Iran_ChL, wyjaśniając, dlaczego qpAdm wymaga trzech populacji źródłowych do wymodeluj to. Aby formalnie przetestować tę hipotezę, użyliśmy qpWave ^{36 , 37 , 38} , który określa minimalną liczbę populacji źródłowych wymaganych do modelowania relacji między „ ”populacjami lewicy w stosunku do”” populacje pozagrupowe. W przeciwieństwie do qpAdm, qpWave nie wymaga, aby do analizy były dostępne populacje blisko spokrewnione z prawdziwymi populacjami źródłowymi. Zamiast tego traktuje jednakowo wszystkie „lewicowe” populacje i próbuje określić minimalną liczbę teoretycznych populacji źródłowych wymaganych do modelowania zbioru „lewicowych” populacji w stosunku do zewnętrznych grup populacji „prawicowych”. Dlatego modelujemy związek między Levant_N, Levant_ChL i Levant_BA_South jako populacje „lewe ” w stosunku do populacji „prawej” grupy zewnętrznej 09NW (Tabela  3). Stwierdzamy, że do modelowania pochodzenia tych populacji lewantyńskich nadal wymagane są co najmniej trzy populacje źródłowe, wspierając model, w którym co najmniej trzy oddzielne źródła przodków są obecne w Lewancie między neolitem, chalkolitem i epoką brązu.

Ponownie zastosowaliśmy qpWave, zastępując Levant_ChL Levant_BA_North i stwierdziliśmy, że minimalna liczba populacji źródłowych to tylko dwie. Jednak gdy uwzględnimy populację Levant_ChL jako dodatkową grupę zewnętrzną, ponownie wymagane są trzy populacje źródłowe. Sugeruje to, że przy braku danych z Levant_ChL nie ma wystarczającej dźwigni statystycznej do wykrycia pochodzenia związanego z Anatolią, które jest naprawdę obecne w postaci zmieszanej w populacji Levant_BA_North (dane z populacji Levant_ChL umożliwiają wykrycie tego przodka). To może wyjaśniać, dlaczego Haber i in. ²⁶ nie wykrył domieszki związanej z anatolijskim neolitem w Levant_BA_North.

Biologicznie ważne mutacje w populacji Peqi’in

To badanie prawie podwaja liczbę osobników z danymi całego genomu ze starożytnego Lewantu. Mierzony w kategoriach średniego zasięgu w SNP, wzrost ten jest jeszcze wyraźniejszy ze względu na wyższą jakość przedstawionych tutaj danych niż w poprzednich badaniach starożytnych mieszkańców Bliskiego Wschodu ^24 , 26 . Zatem niniejsze badanie znacznie zwiększa moc analizy zmiany częstotliwości alleli, o których wiadomo, że są ważne biologicznie.

Wykorzystaliśmy nasze dane do zbadania zmiany częstości alleli SNP, o których wiadomo, że są związane z metabolizmem, pigmentacją, podatnością na choroby, odpornością i stanem zapalnym w populacji Levant_ChL, rozważanej w odniesieniu do częstości alleli w Levant_N, Levant_BA_North, Levant_BA_South, Anatolia_N i Populacje Iran_ChL i obecne pule pochodzenia afrykańskiego (AFR), wschodnioazjatyckiego (EAS) i europejskiego (EUR) w zbiorze danych fazy 3 projektu 1000 genomów ³⁹ (dane uzupełniające  7 ).

Zwracamy uwagę na trzy interesujące ustalenia. Po pierwsze, allel (G) w rs12913832 w pobliżu genu OCA2, z udowodnionym powiązaniem z niebieskim kolorem oczu u osób pochodzenia europejskiego40 , ma szacunkową częstość alleli alternatywnych wynosząca  49% w populacji Levant_ChL, co sugeruje, że fenotyp niebieskookich był powszechny w Levant_ChL.

Po drugie, allel w rs1426654 w genie SLC24A5 , który jest jednym z najważniejszych wyznaczników jasnej pigmentacji u mieszkańców Zachodniej Eurazji41, jest ustalony dla pochodnego allelu ( A ) w populacji Levant_ChL, co sugeruje, że fenotyp o jasnej karnacji mógł być powszechny w tej populacji, chociaż wszelkie wnioski dotyczące pigmentacji skóry na podstawie częstości alleli obserwowanych w jednym miejscu należy traktować z ostrożnością ⁴² .

Po trzecie, allel ( G ) w rs6903823 w genach ZKSCAN3 i ZSCAN31 , który jest nieobecny u wszystkich wczesnych rolników zgłoszonych do tej pory (Levant_N, Anatolia_N, Iran_N) i który, jak argumentowano, był pod pozytywną selekcją przez Mathieson i in. ³¹ , występuje z szacowaną częstością 20% w populacjach Levant_ChL, 17% w Levant_BA_South i 15% w populacjach Iran_ChL, podczas gdy nie występuje we wszystkich innych populacjach. Sugeruje to, że częstość allelu rosła w populacjach z epoki chalkolitu i epoki brązu na Bliskim Wschodzie w tym samym czasie, gdy rosła w Europie.

Okres chalkolitu w Lewancie był świadkiem poważnych przemian kulturowych praktycznie we wszystkich obszarach kultury, w tym w produkcji rzemieślniczej, praktykach pogrzebowych i rytualnych, wzorcach osadnictwa oraz ekspresji ikonograficznej i symbolicznej ⁴³. Obecne badanie zapewnia wgląd w długotrwałą debatę w prehistorii Lewantu, sugerując, że pojawienie się chalkolitycznej kultury materialnej było związane z ruchem i obrotem populacji.

Jakość starożytnego DNA uzyskanego z próbek jaskini Peqi’in jest doskonała w porównaniu z innymi miejscami na Bliskim Wschodzie. Stawiamy hipotezę, że wyjątkowe zachowanie wynika z dwóch czynników. Po pierwsze, ukierunkowane pobieranie próbek starożytnego DNA z części skalistej kości skroniowej umożliwia uzyskanie wysokiej jakości starożytnego DNA z wcześniej niedostępnych regionów geograficznych ^{24 , 27 , 44 , 45} . Po drugie, środowisko jaskini Peqi’in prawdopodobnie sprzyja zachowaniu DNA. Szczątki szkieletu — albo przechowywane w ossuariach, albo złożone w ziemi — zostały szybko pokryte wapienną skorupą, izolując je od bezpośredniego otoczenia i chroniąc przed kwaśnymi warunkami, o których wiadomo, że uszkadzają DNA.

Odkryliśmy, że osoby pochowane w jaskini Peqi’in reprezentują stosunkowo jednorodną genetycznie populację. Ta jednorodność jest widoczna nie tylko w analizach całego genomu, ale także w fakcie, że większość osobników płci męskiej (dziewięć na dziesięć) należy do haplogrupy T chromosomu Y (patrz tabela uzupełniająca 1), linii, o której sądzono,  że zróżnicowana na Bliskim Wschodzie ⁴⁶ . Odkrycie to kontrastuje zarówno z wcześniejszymi (neolitycznymi i epipaleolitycznymi) populacjami lewantyńskimi, które były zdominowane przez haplogrupę E ²⁴, jak i osobnikami z późniejszej epoki brązu, z których wszystkie należały do ​​haplogrupy J ^24 , 26 .

Nasze odkrycie, że populację Levant_ChL można dobrze modelować jako trójskładnikową domieszkę między Levant_N (57%), Anatolią_N (26%) i Iran_ChL (17%), podczas gdy Levant_BA_South można modelować jako mieszaninę Levant_N (58 %) i Iran_ChL (42%), ale ma niewiele, jeśli w ogóle, dodatkowych przodków związanych z Anatolią_N, można wytłumaczyć jedynie wieloma epizodami przemieszczania się populacji. Obecność przodków spokrewnionych z Iranem w obu populacjach – ale nie we wcześniejszym Levant_N – sugeruje historię rozprzestrzeniania się do Lewantu ludów spokrewnionych z irańskimi rolnikami, co musiało nastąpić co najmniej do czasów chalkolitu. Składnik Anatolian_N obecny w próbce Levant_ChL, ale nie w próbce Levant_BA_South sugeruje, że istniało również oddzielne rozprzestrzenianie się ludzi spokrewnionych z Anatolią w regionie. Populacja Levant_BA_South może zatem reprezentować pozostałość populacji, która powstała po początkowym rozprzestrzenieniu się pochodzenia związanego z Iran_ChL do Lewantu, na który nie miało wpływu rozprzestrzenianie się populacji związanej z Anatolią_N, lub być może ponowne wprowadzenie populacji bez populacji związanej z Anatolią_N przodków do regionu. Ponadto stwierdzamy, że populacja Levant_ChL nie służy jako prawdopodobne źródło przodków związanych z Lewantyną we współczesnych populacjach Afryki Wschodniej (patrz Uwaga dodatkowa 4 ) ²⁴ .

Te wyniki genetyczne mają uderzające korelaty ze zmianami kultury materialnej w zapisie archeologicznym. Znaleziska archeologiczne w jaskini Peqi’in mają charakterystyczne cechy charakterystyczne dla innych stanowisk chalkolitycznych, zarówno na północy, jak i na południu, w tym wtórne pochówki w ossuariach z ikonograficznymi i geometrycznymi wzorami. Sugerowano, że niektóre zwyczaje, artefakty i motywy pogrzebowe z późnego chalkolitu mogły mieć swój początek we wcześniejszych tradycjach neolitycznych w Anatolii i północnej Mezopotamii ^{8 , 13 , 47} . Niektóre z form ekspresji artystycznej były związane ze znaleziskami i ideami oraz z późniejszymi koncepcjami religijnymi, takimi jak bogowie Inanna i Dumuzi z tych bardziej północnych regionów ^{6 , 8 , 47 ,48, 49 , 50} . Postawiono hipotezę, że wiedza i zasoby potrzebne do wytworzenia artefaktów metalurgicznych w Lewancie pochodzą ^{z północy 11,51} .

Nasze odkrycie nieciągłości genetycznej między okresami chalkolitu i wczesnej epoki brązu rezonuje również z aspektami zapisów archeologicznych naznaczonych dramatycznymi zmianami we wzorcach osadnictwa ⁴³ , porzucaniem stanowisk na dużą skalę ^{52 , 53 , 54 , 55} , znacznie mniejszą liczbą przedmiotów o znaczeniu symbolicznym oraz zmiany w praktykach pochówku, w tym zniknięcie wtórnego pochówku w ossuariach ^{56 , 57 , 58 , 59} . Potwierdza to pogląd, że głęboki przewrót kulturowy, prowadzący do wyginięcia populacji, wiązał się z upadkiem kultury chalkolitu w tym regionie ^{18 , 60, 61 , 62 , 63 , 64} .

Te starożytne wyniki DNA ujawniają stosunkowo jednorodną genetycznie populację w Peqi’in. Pokazujemy, że ruchy ludności w regionie południowego Lewantu były niezwykle dynamiczne, a niektóre populacje, takie jak ta pochowana w Peqi’in, zostały częściowo ukształtowane przez wpływy egzogeniczne. Badanie to zawiera również studium przypadku istotne poza Lewantem, pokazujące, w jaki sposób połączona analiza danych genetycznych i archeologicznych może dostarczyć bogatych informacji na temat mechanizmu zmian w przeszłych społeczeństwach.

Generowanie danych

Jaskinia grobowa Peqi’in została wykopana pod auspicjami Izraelskiego Urzędu Starożytności (zezwolenie nr 2297/1995). Przeszukaliśmy 46 elementów ludzkiego szkieletu z jaskini Peqi’in, z których 37 to kamienne fragmenty kości skroniowej. Przygotowaliśmy od 15 do 114 mg proszku kostnego dla każdej próbki, wiercąc ze zbitej części próbki po oczyszczeniu powierzchni narzędziem Dremel lub wiercąc w wewnętrznej części ucha skalistej części kości skroniowej ²⁷ . Ekstrahowaliśmy DNA przy użyciu protokołu ekstrakcji opartego na kolumnie krzemionkowej, który został zoptymalizowany pod kątem ekstrakcji starożytnego DNA ²⁸ , modyfikując protokoły, zastępując zespół kolumny MinElute wstępnie zmontowanym urządzeniem z kolumną wirującą, jak w Korlević i in. ⁶⁵. Do proszku kostnego dodaliśmy 1,5 ml buforu ekstrakcyjnego (0,45 M EDTA, pH 8,0 (BioExpress), 0,05% proteinazy K (Sigma)) i inkubowaliśmy w 2,0 ml probówkach w temperaturze 37°C przez noc, obracając. Po inkubacji wirowaliśmy próbki z maksymalną prędkością przez 2 minuty i dodaliśmy 13 ml buforu wiążącego (5 M GuHCl (Sigma), 40% izopropanolu (Sigma), 400 μg octanu sodu (Sigma), pH 5, 2 (Sigma)) do supernatantu. Przenieśliśmy mieszaninę do High Pure Extender z zestawu Viral Nucleic Acid Large Volume Kit (Roche) i wirowaliśmy przy 2000 x g , aż cały płyn zniknął z lejka. Odłączyliśmy kolumnę krzemionkową od lejka, umieściliśmy ją w świeżej 2 ml probówce zbierającej i wirowaliśmy przez 1 minutę przy 8000 x g. Przeprowadziliśmy dwa przemycia, dodając 700 μl buforu PE (Qiagen) do kolumn i wirowano przy 8000 x g przez 30 s, wymieniając probówkę zbierającą po każdym przemyciu. Wykonaliśmy wirowanie na sucho z maksymalną prędkością przez 1 minutę, a następnie wymieniliśmy probówkę zbiorczą. Usunęliśmy eluat DNA z kolumny, dodając 45 μl TTE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (ThermoFisher), 1 mM EDTA, pH 9,0 (BioExpress), 0,05% Tween-20 (Sigma)) do matrycy krzemionkowej , inkubując przez 5 minut, a następnie wirowano z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Powtarzaliśmy ten krok, aż uzyskaliśmy całkowitą objętość 90 μl. W przypadku ponownych prób jednej z próbek przemyliśmy proszek 1 ml 0,5% wybielacza (inkubacja przez 15 minut), a następnie trzykrotnie przemyto 1 ml wody (inkubacja 3 minuty), przed ekstrakcją DNA, jak opisano w Korlević i in. ⁶⁵ (patrz Dane uzupełniające  1 ) i przygotowane biblioteki przy użyciu częściowego leczenia UDG ²⁹(protokoły biblioteczne różniły się nieznacznie w trakcie generowania danych, patrz Dane uzupełniające  1). Dodaliśmy 30 μl ekstraktu do mieszaniny do traktowania USER (1× Buffer Tango (ThermoFisher), 100 μM dNTP Mix (ThermoFisher), 1 mM ATP (ThermoFisher), 0,06 U/μL enzymu USER (NEB)) i inkubowaliśmy reakcję w 37°C przez 30 min. Zahamowaliśmy enzym UDG przez dodanie inhibitora glikozylazy uracylu (0,12 U / μl; NEB) do mieszanki i inkubację przez kolejne 30 minut w 37 ° C. Następnie wykonaliśmy naprawę tępych końców na próbkach, dodając T4 PNK (0,5 U / μl; ThermoFisher) i polimerazę T4 (90,1 U / μl; ThermoFisher) do mieszaniny i inkubując przez 15 min w 25 ° C, a następnie przez 5 min w temp. 12°C. Oczyściliśmy reakcje za pomocą zestawu do oczyszczania MinElute PCR, dodając pięć objętości buforu PB do mieszaniny reakcyjnej, przenosząc do probówki zbiorczej i wirując przez 30 s przy 3300 × g. Odrzuciliśmy płyn i przemyliśmy dwukrotnie, dodając 700 μl buforu PE do kolumny, wirując przez 30 s przy maksymalnej prędkości i odrzucając probówkę zbierającą, a następnie wirując na sucho przez 1 minutę przy maksymalnej prędkości. Eluowaliśmy próbki w 18 μl 10 mM Tris-HCl (ThermoFisher), który dodaliśmy do membrany krzemionkowej i pozostawiliśmy na 5 minut, a następnie wirowano przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Połączyliśmy unikalne adaptery z cząsteczkami w każdej próbce, inkubując mieszaninę próbek w mieszaninie reakcyjnej do ligacji (1 x bufor do ligazy DNA T4 (ThermoFisher), 5% PEG-4000 (ThermoFisher), 0,25 μM adapter P5 (patrz ref. ²⁹ sugerowane informacje dotyczące przygotowania), adapter 0,25 μM P7 (patrz ref. ²⁹sugerowane informacje dotyczące przygotowania), 0,125 U/μl ligazy DNA T4 (ThermoFisher)) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Oczyściliśmy mieszaninę ligacyjną, stosując procedurę oczyszczania opisaną powyżej, eluując 20 μl 10 mM Tris-HCl. Wypełniliśmy zligowane adaptery, dodając mieszaninę reakcyjną do napełniania (1 × bufor ThermoPol (NEB), 250 μM dNTP Mix (ThermoFisher), 0,4 U / μL polimerazy Bst, duży fragment (NEB)) do produktu ligacji i inkubacja w 37°C przez 20 min, a następnie w 80°C przez 20 min. Na koniec amplifikowaliśmy biblioteki za pomocą PCR, dodając 39 μl produktu reakcji wypełnienia do mieszaniny reakcyjnej PCR (1 x Pfu Turbo Cx Reaction Buffer (Agilent Technologies), 0, 4 μM PreHyb-F (5′-CTTTCCCTACACGACGCTTC-3′ ), 0,4 μM PreHyb-R (5′-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT-3′), 0,2 mM dNTP Mix (ThermoFisher), Polimeraza DNA 5U Pfu Turbo Cx Hotstart (Agilent Technologies)). Podzieliliśmy każdą reakcję na porcje po 50 μl i umieściliśmy w szczelnie zamkniętej płytce do PCR. Przeprowadziliśmy wstępną denaturację próbek przez 2 minuty w 95 ° C, a następnie 30 cykli w 95 ° C przez 30 s, 55 ° C przez 30 s, 72 ° C przez 1 minutę i wykonaliśmy końcowe wydłużanie w 72 ° C przez 10 min.

Przeszukaliśmy wszystkie biblioteki pod kątem autentycznego DNA poprzez wzbogacenie genomu mitochondrialnego i 50 docelowych loci jądrowych, a następnie sekwencjonowanie na instrumencie Illumina NextSeq500 przez 2 × 75 cykli i 2 × 7 cykli w celu odczytania wskaźników. Wzbogaciliśmy obiecujące biblioteki o około 1, 2 M SNP, jak opisano w ref. ^{31 , 36 , 66 ,]}a następnie zsekwencjonowano na sekwenatorze NextSeq500 stosując sekwencje sparowanych końców o długości 75 par zasad. Podczas przetwarzania obliczeniowego początkowo usunęliśmy identyfikujące sekwencje oligonukleotydowe i adaptery, oddzielając poszczególne próbki od połączonych przechwyceń przez ich identyfikujące 7-parowe indeksy na końcach 5 'i 3′ odczytów i wymagając dopasowań do kodów kreskowych specyficznych dla próbki dołączonych bezpośrednio do sekwencji fragmentów, dopuszczając nie więcej niż jedną niezgodność na indeks/kod kreskowy. Użyliśmy SeqPrep ⁶⁷ do usunięcia adapterów, a także do łączenia sparowanych odczytów końcowych w pojedyncze sekwencje, wymagając nakładania się co najmniej 15 par zasad (pozwalając na jedno niedopasowanie), używając bazy najwyższej jakości w połączonym regionie, w którym wystąpił konflikt. Użyliśmy samse w bwa (v0.6.1) ⁶⁸wyrównać odczyty. W eksperymencie wzbogacania mitochondrialnego DNA dostosowaliśmy się do genomu mitochondrialnego RSRS ⁶⁹ . W eksperymencie wzbogacania całego genomu dopasowaliśmy się do genomu referencyjnego hg19. Zidentyfikowaliśmy zduplikowane sekwencje jako te z tymi samymi pozycjami początkowymi i końcowymi oraz orientacją, a także identycznymi parami kodów kreskowych i zachowaliśmy sekwencję najwyższej jakości z każdego duplikatu. Wykonaliśmy pseudo-haploidalne wywołania SNP dla każdej pozycji, używając losowo wybranej sekwencji obejmującej każde miejsce docelowe, usuwając dwie zasady na końcach każdej sekwencji, aby usunąć mutacje deaminowane i wymagając minimalnej jakości mapowania (MAPQ ≥ 10) i ograniczając się do strony o minimalnej podstawowej jakości (≥20).

Oceniliśmy jakość każdej biblioteki na etapie badań przesiewowych, stosując trzy standardowe metody określania autentyczności starożytnego DNA. Najpierw przeanalizowaliśmy dane genomu mitochondrialnego, aby określić stopień dopasowania do sekwencji konsensusowej, używając contamMix ³⁰ . Po drugie, ograniczyliśmy się do próbek, w których wskaźnik podstawień C-to-T w końcowych nukleotydach wynosił co najmniej 3%, zgodnie z oczekiwaniami dla prawdziwego starożytnego DNA przy użyciu protokołu częściowego leczenia UDG ²⁹. Na koniec wykorzystaliśmy oprogramowanie ANGSD, aby uzyskać konserwatywne oszacowanie zanieczyszczenia chromosomu X osób określonych jako męskie w oparciu o szybkość polimorfizmu sekwencji chromosomu X (mężczyźni mają tylko jeden chromosom X, więc nie oczekuje się wykazać polimorfizm); wykluczyliśmy biblioteki z szacunkami zanieczyszczenia X większymi niż 1,5% ³² . W przypadku próbek, w których wyprodukowano wiele bibliotek dla jednego osobnika, połączyliśmy biblioteki, które przeszły kontrolę jakości i uzyskaliśmy nowe pseudo-haploidalne wywołania SNP.

Określiliśmy haplogrupy mitochondrialnego DNA za pomocą narzędzia haplogrep2 ⁷⁰ , stosując sekwencję konsensusową zbudowaną z odczytów wzbogaconych o genom mitochondrialny, ograniczając się do uszkodzonych odczytów przy użyciu PMDtools ⁷¹ (pmdscore ≥ 3) i przycinając 5 zasad z każdego końca, aby znacznie zmniejszyć wskaźnik błędów w wyniku deaminacji.

Starożytne DNA stanowi wyzwanie przy przypisywaniu haplogrup chromosomu Y ze względu na możliwość zanieczyszczenia, uszkodzenia DNA lub brakujących danych. Aby przypisać haplogrupy Y do naszych danych, wykorzystaliśmy zmodyfikowaną wersję procedury stosowanej w analizie współczesnych chromosomów Y w projekcie 1000 genomów 72, ^który wykorzystuje przeszukiwanie wszerz w celu przeszukania drzewa chromosomu Y. Wezwania wykonaliśmy na drzewie ISOGG od 04.01.2016 [ http://isogg.org] i zmodyfikował wywołującego, aby wyprowadzał wywołania alleli pochodnych i przodków dla każdej pozycji informacyjnej w drzewie. Następnie przypisaliśmy wynik do każdej z haplogrup referencyjnych, licząc liczbę niedopasowań w liczbie obserwowanych alleli pochodnych na tej gałęzi i zmniejszonych mutacjach pochodnych, które były przejściami do 1/3 transwersji, aby uwzględnić błędy związane z uszkodzeniem DNA . Przypisaliśmy próbkę do haplogrupy referencyjnej z najbliższym dopasowaniem na podstawie tego wyniku. Chociaż staraliśmy się wywołać wezwanie dla każdej próbki, zauważamy, że próbki z mniej niż 100 000 SNP mają zbyt mało danych, aby z pewnością zidentyfikować prawidłową haplogrupę, i zachęcamy do ostrożności przy interpretacji tych wyników.

Dane z 22 próbek, które przeszły testy zanieczyszczenia i kontroli jakości, przedstawiono w tabeli uzupełniającej  1 , przy średnim pokryciu 0, 97 × na 1240 k celów SNP i średnio 358 313 SNP objętych co najmniej raz. Tabela według biblioteki opisująca wyniki badań przesiewowych jest przedstawiona w danych uzupełniających  1 . Wykluczyliśmy dwie osoby z dalszej analizy, ponieważ wzorce genetyczne zaobserwowane przy użyciu metody opisanej w Kuhn et al. ⁷³ . Pokazano, że byli krewnymi pierwszego stopnia próbek o wyższym pokryciu w zbiorze danych. Ograniczyliśmy dane z próbki I1183, aby obejmowały tylko sekwencje z dowodami podstawienia C-to-T, aby zminimalizować zanieczyszczenie, które było widoczne w pełnych danych z tych próbek.

Połączyliśmy nowo zgłoszone dane z istniejącymi danymi z Lazaridis i in. ²⁴ oraz Haber i in. ²⁶ , używając programu scalania firmy EIGENSOFT ³³ . Powstałe zestawy danych, określane jako HO + i HOIll+, zawierają 20 nowych niepowiązanych próbek połączonych z HO i HOI ll z Lazaridis i in. ²⁴ i 5 starożytnych próbek z Sydonu w Libanie (nazwa populacji: Levant_BA_North) z Haber et al. ²⁶ , odpowiednio. HO+ obejmuje dane od 2891 współczesnych i starożytnych osobników z 591 642 SNP, a HOIll+ zawiera dane od 306 starożytnych osobników z 1 054 637 SNP.

Analiza głównych składowych

Przeprowadziliśmy PCA na zbiorze danych HO + przy użyciu smartpca ³³ . Wykorzystaliśmy w sumie 984 współczesnych osobników do PCA i przewidzieliśmy 306 starożytnych próbek. Użyliśmy domyślnych parametrów z ustawieniami lsqproject: YES i numoutlieriter: 0. Oszacowaliśmy F _ST za pomocą smartpca dla 21 starożytnych populacji Bliskiego Wschodu składających się z więcej niż jednego osobnika i 8 współczesnych populacji przy użyciu parametrów domyślnych, z chowem wsobnym: TAK i fstonly: TAK (Rysunek dodatkowy 1  ) . Przeprowadziliśmy analizy przy użyciu zestawu danych HO +.

Domieszka

Przeprowadziliśmy analizę ADMIXTURE ³⁴ na zbiorze danych HO+. Przed analizami przycinaliśmy SNP w silnej nierównowadze powiązań ze sobą za pomocą PLINK ⁷⁴ przy użyciu parametrów — niezależnie od par 200 25 0,4. Przeprowadziliśmy analizę ADMIXTURE na 3 00 885 SNP pozostałych w przyciętym zbiorze danych. Dla każdej wartości k między 2 a 14 wykonaliśmy 20 analiz powtórzeń i zachowaliśmy replikację o najwyższym prawdopodobieństwie dla każdego k .

Warunkowa heterozygotyczność

Obliczyliśmy warunkową heterozygotyczność dla każdej starożytnej populacji lewantyńskiej za pomocą popstats ⁷⁵ . Do tej analizy wykorzystaliśmy zestaw danych HO +, ograniczając się do miejsc SNP ustalonych od pojedynczego osobnika Yoruba i do SNP transwersji, jak opisano w Skoglund i in. ⁴⁴ .

f -statystyki

Obliczyliśmy statystyki f ₄ za pomocą programu qpDstat w ADMIXTOOLS ³⁵ z parametrami domyślnymi i trybem f ₄ : TAK. Obliczyliśmy statystyki f ₃ za pomocą programu qp3Pop w ADMIXTOOLS ³⁵ , używając parametrów domyślnych, z chowem wsobnym: TAK. Przeprowadziliśmy wszystkie analizy przy użyciu zestawu danych HOIll +, z wyjątkiem statystyki f ₄ (Levant_BA_North, Levant_BA_South; A, Chimp), którą przeprowadziliśmy na zbiorze danych HO +.

qpAdm

Oszacowaliśmy proporcje przodków w populacji Levant_ChL za pomocą metodologii qpAdm, z parametrami allsnps: TAK i szczegóły: TAK ³⁶ . Przetestowaliśmy zarówno 2-, jak i 3-drożne domieszki między starożytnymi „lewicowymi” populacjami ze zbioru danych HOIll+. Wykorzystaliśmy populacje 09NW zdefiniowane w Lazaridis i in. ²⁴ jako wstępne grupy zewnętrzne. Wybraliśmy dodatkowe grupy zewnętrzne na podstawie statystyk f ₄ (Anatolia_N, Europa_EN; A, szympans) i f ₄ (Levant_BA_North, Iran_ChL; A, szympans) i powtórzyliśmy qpAdm z każdą dodatkową grupą zewnętrzną dodaną do listy „Prawo”, aż wszystkie oprócz wyeliminowano jeden model z domieszką.

Użyliśmy qpAdm do określenia, czy populacje Levant_BA_South i Levant_BA_North można modelować przy użyciu Levant_ChL jako populacji źródłowej. Przetestowaliśmy dwukierunkowe domieszki między Levant_ChL i każdą inną starożytną „lewicową” populacją ze zbioru danych HOIll +. Przetestowaliśmy również „lewicowe” populacje Levant_N i Iran_ChL. Wykorzystaliśmy populacje 09NW „Right ” jako wstępne populacje grup zewnętrznych i potwierdziliśmy nasze ustalenia dla Levant_BA_North przy użyciu grup zewnętrznych zdefiniowanych w Haber et al. ²⁶ . Dodaliśmy dodatkowe grupy zewnętrzne, aby jeszcze bardziej rozróżnić wiarygodne modele i powtarzaliśmy analizę qpAdm, aż wszystkie modele domieszek z wyjątkiem jednego zostały wyeliminowane.

qpWave

Obliczyliśmy minimalną liczbę strumieni przodków wymaganych do modelowania dwóch zestawów trzech populacji lewantyńskich (zestaw [1] Levant_N, Levant_ChL i Levant_BA_South, zestaw [2] Levant_N, Levant_BA_South, Levant_BA_North) przy użyciu metodologii qpWave 37, ^{38 z parametrem} allsnps :TAK.

Porównania częstości alleli

Zbadaliśmy częstości SNP związane z fenotypowo ważnymi funkcjami w kategoriach metabolizmu, pigmentacji, podatności na choroby, odporności i stanu zapalnego w Levant_ChL w połączeniu z populacjami Levant_N, Levant_BA_North, Levant_BA_South, Anatolia_N i Iran_ChL, z częstościami alleli dla trzech połączonych populacji kontynentalnych populacje (AFR, EAS, EUR) w fazie 3 projektu 1000 genomów zgłoszone, jeśli są dostępne. Obliczyliśmy częstości alleli w każdym interesującym miejscu, obliczając prawdopodobieństwo częstości alleli referencyjnych populacji na podstawie danych, stosując metodę ustaloną w Mathieson i in. ³¹ . Dla każdej populacji o wielkości N obserwujemy sekwencje Ri _, które posiadają allel referencyjny z całościT _i sekwencje. Prawdopodobieństwo odniesienia częstości alleli p k , n , p ) = , w każdej populacji dane D  = { X , N , R _ja , T _ja } wynosi L ( p ; D ) =  gdzie B (∏ja = 1N{P2B (RI,TI, 1 – ε )+2p( 1 – p )b(RI,TI, 0.5 )+(1–str)2B (RI,TI, ε )}∏�=1�⁡{�2�(��,��,1−ε)+2�(1−�)�(��,��,0,5)+(1−�)2�(��,��,ε)}(Nk)Pk( 1 − s)n – k(��)��(1−�)�−� wynosi dwumianowy rozkład prawdopodobieństwa, a to małe prawdopodobieństwo błędu, które dla naszych obliczeń ustawiliśmy na 0,001. Oszacowaliśmy częstości alleli, maksymalizując liczbowo prawdopodobieństwo dla każdej populacji.εε

Dostępność danych

Dopasowane sekwencje są dostępne w Europejskim Archiwum Nukleotydów pod numerem dostępu PRJEB27215. Zestawy danych genotypów wykorzystywane w analizie są dostępne pod adresem https://reich.hms.harvard.edu/datasets .