5000-letni myśliwy-zbieracz był już nękany przez Yersina pestis (bakterię dżumy)/ Julian Susat, Harald Lubke, Aleksander Immel, Valdis Bērziņš, Almut Nebel, Ben Krause Kyora,

0
96

Przegląd najważniejszych wydarzeń

Yersinia pestis zostaje odkryta u 5000-letniego łowcy-zbieracza z Łotwy

Y. pestis pojawił się „7000 lat temu na początku neolitu”

Zakażony osobnik może stanowić przypadek dżumy posocznicowej spowodowanej chorobą odzwierzęcą

Streszczenie

5000-letni genom Yersinia pestis (RV 2039) został zrekonstruowany u myśliwego-rybaka-zbieracza (5300-5050 cal BP) pochowanego w Riņņukalns na Łotwie. RV 2039 jest pierwszym z serii starożytnych szczepów, które wyewoluowały wkrótce po oddzieleniu się Y. pestis od jego poprzednika Y. pseudotuberculosi – 7000 lat temu. Genomowe i filogenetyczne cechy RV 2039 są zgodne z hipotezą, że ta bardzo wczesna forma Y. pestis była najprawdopodobniej mniej przenośna i być może nawet mniej zjadliwa niż późniejsze szczepy. Nasze dane nie potwierdzają scenariusza prehistorycznej pandemii dżumy płucnej, jak sugerowano wcześniej dla schyłku neolitu. Rozmieszczenie geograficzne i czasowe nielicznych prehistorycznych Y. pestis zgłoszone dotychczas przypadki są bardziej zgodne z pojedynczymi zdarzeniami odzwierzęcymi.

Słowa kluczowe

Wstęp

Stanowisko archeologiczne z muszlami w Riņņukalns znajduje się na Łotwie, obok rzeki Salaca, która wpływa do Morza Bałtyckiego (Rysunek 1A). Sam muszlowiec składa się z naprzemiennych warstw niespalonych muszli słodkowodnych, spalonych muszli małży i ości ryb, które zostały zdeponowane przez działalność człowieka w krótkim okresie 100-200 lat na początku 6 tysiąclecia przed teraźniejszością (BP) (Bērziņš i in., 2014; Brinker i in., 2020). W 1875 r. archeolog amator Carl Georg Count Sievers (1814–1879) przeprowadził pierwsze systematyczne wykopaliska w Riņņukalns. Sievers wykrył w dwóch pojedynczych grobach szczątki szkieletowe kobiety w wieku od 12 do 18 lat (RV 1852) i mężczyzny w wieku od 20 do 30 lat (RV 2039; ryc. 1B i 1C; tabela 1), zakryte przez nienaruszone warstwy midden. Ze względu na położenie stratygraficzne przyjął prehistoryczny kontekst tych pochówków (Siewersy, 1875). Ta interpretacja była wówczas uważana za błędną i dlatego spotkała się z zaciekłym oporem (Grewingk, 1878; Brinker i in., 2018). Aby potwierdzić swoją hipotezę i badania osteologiczne, Sievers wysłał czaszki okazy RV 1852 i RV 2039, między innymi szczątki ludzkie z Riņņukalns, swojemu przyszłemu mentorowi i przyjacielowi, znanemu już na całym świecie niemieckiemu lekarzowi Rudolfowi Virchowowi (1821–1902) z Berlina (Virchow, 1877). Virchow jest nadal bardzo znany jako twórca dziedzin patologii komórkowej, podstaw współczesnej medycyny i medycyny społecznej. W 1869 r., ze względu na wielkie zainteresowanie pra- i protohistorią, został założycielem Berlińskiego Towarzystwa Antropologicznego (dziś znanego jako Berliner Gesellschaft für Anthropologie, Ethnologie und Urgeschichte [BGAEU]. Pomimo swojej światowej reputacji, Virchow użyczał badaczom-amatorom, takim jak Heinrich Schliemann i Sievers, swojej wiedzy specjalistycznej do ich projektów archeologicznych, nie odstraszając się odmiennymi poglądami jego współczesnych. Przekonany przez Sieversa o znaczeniu swoich znalezisk, Virchow zbadał cały materiał Riņņukalns i opublikował pierwszy raport (Brinker i in., 2018; Virchow, 1877). Po II wojnie światowej wydawało się, że czaszki Riņņukalns zniknęły, a ich miejsce pobytu uznano za nieznane, ale w 2011 roku czaszki zostały ponownie odkryte w zinwentaryzowanej Kolekcji Antropologicznej Rudolfa Virchowa BGAEU, gdzie najwyraźniej były przechowywane (Lübke i in., 2016). Równolegle z poszukiwaniami czaszki, nowe badania terenowe na stanowisku Riņņukalns doprowadziły do wykrycia dwóch dodatkowych pochówków: dorosłego mężczyzny (2017/1) i noworodka (2018/1) (Tabela 1; Brinker i in., 2020). Również w przypadku tych szczątków szkieletowych stratygrafia archeologiczna wskazała na prehistoryczne pochodzenie. Wszystkie cztery próbki, w tym RV 1852 i RV 2039 z kolekcji Virchowa, zostały następnie datowane radiowęglowo na 5300–5050 cal (lata kalibrowane) BP, potwierdzając w ten sposób pierwotną ocenę Sieversa (Brinker i in., 2020). Pochowane w składowisku muszli i kości osobniki należały do grupy złożonych z myśliwych-rybaków-zbieraczy (Amesa, 2014). Najprawdopodobniej zamieszkiwali półstałe lub stałe osady nad brzegiem rzeki Salaki. Cenne zasoby pożywienia wodnego z pewnością dostarczały wystarczającej ilości pożywienia do całorocznego zamieszkania (Brinker i in., 2020).

Rysunek 1 Położenie geograficzne Riņņukalns

Tabela 1 Przegląd próbek i wyników mapowania

Genom ludzki (hg19)

Próbka

Materiał

Wygenerowane odczyty w młynie. (surowe odczyty)

Przycięte i połączone odczyty w młynie.

Odczyty

zmapowane z hg19 w młynie.

Obrażenia 1. podstawa 5′, %

Obrażenia 1. podstawa 3′, %

Liczba SNP z panelu 1240K

Płeć

Wiek

w momencie

śmierci

RV 1852

kość/ząb skalisty

74,7

39,9

25,4

4.4

4.1

236 243

kobieta

12-18 lat

RV 2039

ząb

3160

1650

84,4

4,7

4.1

394 544

mężczyzna

20-30 lat

2017/01

kość/ząb skalisty

20,2

11,4

6,6

7,9

6,8

77 798

mężczyzna

35-45 lat

2018/1

kość skalista

2,9

1,4

1,0

7,9

7,3

11 509

38-40 tygodni prenatalnych

 

Y. pestis , próbka RV 2039

Odniesienie

Wyrównane odczyty

Pokrycie ≥1×, %

Pokrycie ≥2×, %

Pokrycie ≥3×, %

Średnie pokrycie

całego

odniesienia

chromosom NC_003143.1

600 065

92,39

86,75

78,29

5,85×

pMT1 NC_003134.1

2144

46,62

21.28

8.88

0,83×

pPCP1 NC_003132.1

1050

78,05

72,24

66,14

5,10×

pCD1 NC_003131.1

18 005

92,04

90,31

87,88

12.00×

 

Ponieważ niewiele wiadomo na temat składu genomowego łowców-zbieraczy, którzy żyli w północno-wschodniej Europie 5000 lat temu, ani o ich obciążeniu chorobami zakaźnymi, poddaliśmy cztery osobniki Riņņukalns starożytnej analizie DNA (aDNA), która obejmowała również badanie przesiewowe pod kątem patogenów. Co zaskakujące, u jednego samca zidentyfikowaliśmy genom Yersinia pestis, czynnika zakaźnego odpowiedzialnego za co najmniej trzy historyczne epidemie dżumy (Wagner i in., 2014). Nasze odkrycie przedstawia dowody istnienia tej bakterii u myśliwego-zbieracza i rzuca więcej światła na bardzo wczesne fazy ewolucji i dywersyfikacji Y. pestis.

Wyniki

Wygenerowaliśmy sekwencje obejmujące cały genom z różnych elementów szkieletowych (zębów, kości skalistych) czterech osobników Riņņukalns (Tabela 1). Przebadaliśmy zestawy danych pod kątem obecności znanych patogenów bakteryjnych i wirusowych, korzystając z ustalonego wewnętrznego rurociągu (Krause-Kyora i in., 2018a, Krause-Kyora i in., 2018b;Susat i in., 2020). W próbce RV 2039 (Figura 1; datowana na 5300-5050 cal BP) zaobserwowaliśmy odczyty specyficzne dla Y. pestis , które wykazywały typowe wzorce uszkodzeń aDNA i rozkłady długości, potwierdzając w ten sposób starożytne pochodzenie sekwencji (Tabela 1). Pozostałe szczątki nie wykazywały oznak Y. pestis. W przypadku RV 2039 zrekonstruowaliśmy genom Y. pestis (tj. chromosom, plazmidy pCD1 i pPCP1) przy wysokim pokryciu (Tabela 1). Plazmid pMT1 nie zawierał 20-kb regionu zawierającego czynnik wirulencji ymt ; ta cecha została opisana wcześniej dla innych starożytnych szczepów Y. pestis (Andrades Valtueña i in., 2017). Analiza filogenetyczna z 278 genomami (w tym RV 2039, 276 wcześniej opublikowanymi starożytnymi i współczesnymi genomami Y. pestis oraz jednym genomem Y. pseudotuberculosis; Tabela S1) umieściła RV 2039 u podstaw wszystkich znanych bakterii Y. pestis (Figura 2). Szczep Riņņukalns posiadał własny klad i zaznaczył pierwsze rozgałęzienie po oddzieleniu od bakterii Y. pseudotuberculosis. RV 2039 był wyraźnie oddzielony od wszystkich później datowanych szczepów neolitu i epoki brązu (Figura 3). Analiza TempEst oparta na 42 wybranych genomach, w tym RV 2039, wskazała na sygnał czasowy w filogenezie molekularnej (Rysunek S1). Aby oszacować czasy rozbieżności, przeprowadziliśmy analizy zegara molekularnego przy użyciu BEAST2 z dwoma niezależnymi przebiegami. Pierwszy bieg opiera się na zakorzenionym drzewie startowym, które BEAST2 może zmieniać; w drugim przebiegu nie przewidziano drzewa startowego (rysunki 3 i S2). Wyniki obu analiz były zgodne i wykazały, że RV 2039 różnił się od wszystkich innych bakterii Y. pestis 7100 cal BP (z drzewem startowym 8693–5669 cal BP; bez drzewa startowego 8895–5733 cal BP). Podział na Y. pestis i Y. pseudotuberculosis datowano na ok. 7400 kcal BP (z drzewem startowym 9069–5782 k. BP; bez drzewa startowego 9223–5833 k. BP).

Rysunek 2 Drzewo największej wiarygodności

Rysunek 3 Estymacja zegara molekularnego (bez drzewa startowego) współczesnych i starożytnych szczepów Y. pestis

Badanie struktury genomowej RV 2039 doprowadziło do odkrycia 106 wyłącznych SNP, o których nie wiadomo, aby miały wpływ na czynniki wirulencji ( Tabela S2 ). Oprócz genu ymt , którego brak jest specyficzny dla kladu neolitu/epoki brązu, nie brakowało żadnego innego czynnika wirulencji. Powiązane z wirulencją geny ureD , flhD i pde2 oraz aktywator plazminogenu pla wykazywały stany przodków, jak już pokazano dla linii neolitu i epoki brązu (Andrades Valtueña i in., 2017; Demeure i in., 2019). Wyniki analiz genomicznych i filogenetycznych zostały poparte wiekiem archeologicznym RV 2039, co czyni go jedną z najwcześniejszych linii w ewolucji Y. pestis .

Aby potwierdzić obecność Y. pestis w RV 2039 na poziomie białka, przeprowadziliśmy analizę proteomiczną opartą na chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS). Zidentyfikowaliśmy trzy różne peptydy z trzech białek, które są specyficzne dla Y. pestis (Figura S3) wraz z ~118 ludzkimi białkami.

Zawartość ludzkiego endogennego DNA w czterech zestawach danych była wystarczająca do przeprowadzenia analiz genomicznych pokrewieństwa i populacji u czterech osobników Riņņukalns (Tabela 1). Analiza pokrewieństwa nie dostarczyła dowodu na pokrewieństwo pomiędzy czterema osobnikami pochowanymi w składowisku skorup muszli. Wszystkie cztery miały duży komponent genetyczny pochodzenia, który jest specyficzny dla łowców-zbieraczy. W szczególności mieli duże powinowactwo do łowców-zbieraczy Europy Wschodniej (Rysunek S4), którzy zamieszkiwali duży obszar rozciągający się od Morza Bałtyckiego po stepy pontyjsko-kaspijskie (Mathieson i in., 2018).

Dyskusja

Zrekonstruowaliśmy 5000-letni genom Y. pestis (RV 2039) ze szczątków dorosłego mężczyzny (datowane na 5300-5050 cal BP), który został pochowany w muszli w Riņņukalns na Łotwie. Diagnoza ta została niezależnie potwierdzona przez wykrycie w próbce trzech białek specyficznych dla Y. pestis. RV 2039 jest podstawą dla wszystkich znanych starożytnych lub współczesnych bakterii Y. pestis. Reprezentuje bardzo wczesną, niezależną linię, która pojawiła się około 7000 lat temu, zaledwie kilkaset lat po oddzieleniu się kodu Y. pestis od jego poprzednika Y. pseudotuberculosis. Nasza data 7400 cali BP dla tego podziału jest o 1000 lat wcześniejsza niż poprzednio zgłoszone szacunki (Andrades Valtueña i in., 2017; Demeure i in., 2019; Rascovan i in., 2019; Rasmussen i in., 2015; Spyrou i in., 2018). Kolejne rozgałęzienia i promieniowanie geograficzne Y. pestis na dużą skalę miały miejsce między 7000 a 5000 lat temu (Andrades Valtueña i in., 2017; Demeure i in., 2019; Rascovan i in., 2019; Rasmussen i in., 2015; Spyrou i in., 2018). Ten zakres czasowy zbiega się z początkiem okresu neolitu w Europie (ok. 7500–5000 cali BP), a nie z jego spadkiem, jak sugerowano wcześniej (Rascovan i in., 2019).

RV 2039 oznacza początek ewolucji Y. pestis i jest pierwszym z serii starożytnych szczepów, które ostatecznie wymarły. RV 2039 i jego nieco młodszy krewny, genom Gok2 od rolnika neolitu w Szwecji (datowany na 5040-4867 cal BP), są oddzielnymi gałęziami i oba różnią się od później datowanych szczepów z neolitu i epoki brązu (Rascovan i in., 2019). Oprócz RV 2039 i Gok2 w ludzkich szczątkach z Estonii, Litwy i Szwecji zidentyfikowano jeszcze cztery bardzo wczesne genomyY. pestis, co odzwierciedla godną uwagi akumulację Y. pestis – pozytywnych znalezisk w północno-wschodniej Europie (Andrades Valtueña i in., 2017; Rascovan i in., 2019; Rasmussen i in., 2015; Spyrou i in., 2018).

Dowody archeologiczne i izotopowe wyraźnie wykazały, że zarażony osobnik z Riņņukalns prowadził tryb życia i dietę (opartą na zasobach słodkowodnych), które są zazwyczaj kojarzone z łowcami-zbieraczami z regionu Morza Bałtyckiego w tym czasie (Meadows i in., 2018). Dane genomowe człowieka potwierdzają tę przynależność kulturową i wskazują na silne powiązanie ze wschodnimi łowcami-zbieraczami, którzy przemierzali leśną strefę stepową między Morzem Czarnym i Bałtyckim w szóstym tysiącleciu BP (Mathieson i in., 2018). Lokalizacja „bramy” Riņņukalns i artefakty archeologiczne pokazują, że stanowisko było integralną częścią wymiany na duże odległości za pośrednictwem sieci rzecznych Niziny Wschodnioeuropejskiej (Loze, 2001;Núñez i Franzén, 2011;Kriiska, 2015). Taki system wymiany był widocznie utrzymywany dzięki intensywnym i regularnym kontaktom między grupami ludzkimi.

Współczesny Y. pestis może przenosić się ze zwierząt (np. gryzoni) na ludzi (Demeure i in., 2019). Możliwe, że łowcy-zbieracze, którzy często zabijali gryzonie dla pożywienia lub dekoracji osobistych, zarazili się Y. pestis lub jego poprzednikiem Y. pseudotuberculosis bezpośrednio od zwierząt. Co ciekawe, na stanowisku Riņņukalns bóbr (Castor fiber) był najczęściej notowanym gatunkiem wśród znalezisk archeologicznych wykopanych przez Sieversa (Rutimeyer, 1877). Bobry są powszechnym nosicielem Y. pseudotuberculosis, która bezpośrednio poprzedza nasz wczesny szczep Y. pestis (Gaydos i in., 2009). Pomimo tej interesującej obserwacji, nie wiadomo, w jakim stopniu łowcy-zbieracze mogli odegrać rolę w pojawieniu się odzwierzęcego, wczesnej ewolucji lub rozprzestrzenianiu się Y. pestis.

Chociaż łowca-zbieracz z Riņņukalns był zarażony Y. pestis, nie jest jasne, czy i w jakim stopniu był rzeczywiście dotknięty przez zarazę. RV 2039 nie posiadał jeszcze elementów genetycznych do adaptacji pcheł potrzebnych do skutecznego przenoszenia bakterii na człowieka (dżuma dymienicza). Jednak dane genomowe sugerują, że teoretycznie był zdolny do rozprzestrzeniania się do płuc (dżuma płucna) i infekowania innych gospodarzy poprzez kropelki. Jednak dżuma płucna jest dziś rzadka i prawdopodobnie była również rzadka w przeszłości. Ponadto brak mutacji I259T w genie pla mógł osłabić możliwości rozprzestrzeniania się RV 2039, pozwalając jedynie na zlokalizowane ogniska dżumy płucnej (Zimbler i in., 2015). RV 2039 mógł być również przenoszony bezpośrednio przez ugryzienie przez gryzonia lub mięsożercę, prowadząc do dżumy posocznicy, która zwykle ogranicza się do zakażonego osobnika. Ponadto, w odniesieniu do innych czynników zjadliwości, RV 2039 konsekwentnie wykazywał allele przodków typowe dla Y. pseudotuberculosis, bakterii jelitowej, o której wiadomo również, że powoduje chorobę (Bertelli i in., 2014). RV 2039 dzielił wiele cech przodków z innymi szczepami z epoki neolitu/brązu. Dopiero tysiąclecia później (około 3800 cali BP) Y. pestis nabyła wszystkie mutacje do przenoszenia przez pchły (Demeure i in., 2019). Ten etap jest uważany za kluczowy w ewolucji Y. pestis, ponieważ wymagał śmierci żywiciela, aby zapewnić przetrwanie bakterii za pośrednictwem wektora pcheł (Brubaker, 1991). W ten sposób późniejsze naciski selekcyjne ułatwiły mechanizmy promujące inwazję tkanek ludzkich, bakteriemię i śmiertelność, które zmieniły dżumę dymieniczą w wysoce śmiertelną chorobę (Brubaker, 1991).

Co ciekawe, w zestawie danych RV 2039 odczyty specyficzne dla Y. pestis były bardzo częste, chociaż zostały wygenerowane przez sekwencjonowanie ze strzelbą bez wcześniejszego wzbogacenia. Wiele innych prehistorycznych genomów Y. pestis zostało również zebranych tylko na podstawie danych ze strzelby (Andrades Valtueña i in., 2017; Rascovan i in., 2019; Rasmussen i in., 2015; Spyrou i in., 2018). Obfitość Y. pestis odczytywana w ekstraktach aDNA sugeruje wysokie obciążenie bakteryjne w krwioobiegu chorego w chwili śmierci. Co ciekawe, eksperymenty z infekcjami różnymi gatunkami Yersinia u myszy wykazały ujemną korelację między liczbą bakterii w stadium terminalnym a ich zjadliwością (Brubaker, 1991). Kuszące jest postawienie hipotezy, że ta korelacja dotyczy również różnych starożytnych szczepów Y. pestis. Jeśli to prawda, prehistoryczne szczepy z wysokim obciążeniem bakteryjnym mogły mieć niższą zjadliwość. Nie oznacza to jednak, że te szczepy były nieszkodliwe. Biorąc pod uwagę ich obecność we krwi zarażonych, nadal mogły być potencjalnie śmiertelne dla danej osoby.

Trzeba przyznać, że jak dotąd nie ma dostępnych eksperymentalnych informacji na temat patogeniczności pradawnych szczepów Y. pestis. Dlatego trudno jest ocenić ich zdolność do wywołania choroby o rozmiarach epidemii. Możliwe konsekwencje zakażenia dla populacji pod względem obciążenia chorobą są nadal nieznane. Jednak na podstawie danych genomowych nie można wykluczyć, że RV 2039 i inne wczesne formy były mniej przenośne niż późniejsze szczepy, prowadząc jedynie do lokalnych ognisk (Zimbler i in., 2015). W tym kontekście warto zauważyć, że prawie wszystkie zakażone osobniki prehistoryczne (oprócz Goka2) reprezentowały sporadyczne przypadki i były regularnie chowane w pojedynczych lub wielokrotnych pochówkach. Również mężczyzna z Riņņukalns został starannie pochowany, podobnie jak pozostałe trzy ówczesne osobniki, u których nie znaleźliśmy żadnych śladów Y. pestis. Odkrycia te przemawiają przeciwko zarażeniu całej grupy bakterią, która zabija swoich gospodarzy w ciągu kilku dni, jak można by się spodziewać w przypadku dżumy płucnej. Tak więc można sobie wyobrazić, że osobnik Y. pestis-dodatni zaraził się bakterią poprzez ukąszenie przez zwierzę (zoonoza), powodując posocznicową postać dżumy. Na tym etapie przedwczesne wydaje się powiązanie obecności wczesnego genomu Y. pestis w około tuzinie ludzkich szkieletów na rozległym kontynencie euroazjatyckim i przez okres około 2 tysiącleci z prehistoryczną pandemią dżumy płucnej, jak to miało miejsce ostatnio (Rascovan i in., 2019). Taki wzorzec dystrybucji wydaje się bardziej spójny ze scenariuszem izolowanych zdarzeń odzwierzęcych na słabo zaludnionych obszarach.

Nasze badanie pokazuje moc nowoczesnej technologii sekwencjonowania aDNA w wykrywaniu pradawnych patogenów, zwłaszcza bakterii, takich jak Y. pestis, które nie pozostawiają charakterystycznych zmian na kościach. Dzięki dostępnemu wówczas zestawowi narzędzi naukowych Virchow nie był w stanie zdiagnozować dżumy na czaszce Riņņukalns. Jednak dzięki postępowemu naukowemu podejściu Virchowa, szczątki wykopane przez Sieversa były przechowywane w jego kolekcji, gdzie przetrwały bez szwanku koleje czasu, tak że późniejsza diagnoza była nadal możliwa, nawet po 145 latach.

 Metody

Tabela kluczowych zasobów

ODCZYNNIK lub ZASOBÓW

ŹRÓDŁO

IDENTYFIKATOR

Próbki biologiczne

Ludzkie szczątki archeologiczne

To badanie

ENA: PRJEB42185, https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB42185

Oprogramowanie i algorytmy

Klip i scalanie v1.7.7

Peltzer i in., 2016

https://github.com/apeltzer/ClipAndMerge

MALT v0.4.1

Herbig i in., 2016

https://software-ab.informatik.uni-tuebingen.de/download/malt/welcome.html

BWA v0.7.15

Li i Durbin, 2009

https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/

MapaObrażenia v2

Jónsson i in., 2013

https://ginolhac.github.io/mapDamage/

GATK v3.4-0-g7e26428

McKenna i in., 2010

https://github.com/broadinstitute/gatk/releases

MultiVCFAnalyzer v0.85.1

Bos i in., 2014

https://github.com/alexherbig/MultiVCFAnalyzer/releases

RAxML v8.2.12

Stamatakis, 2014

https://github.com/stamatak/standard-RAxML

MrBayes v3.2.7a

Huelsenbeck i Ronquist, 2001

https://github.com/NBISweden/MrBayes/tree/v3.2.7a

TempEst v1.5.3

Rambaut i in., 2016

http://tree.bio.ed.ac.uk/software/tempest/

BEAST2 v2.6

Bouckaert i in., 2019

https://www.beast2.org/

Tracer v1.7.1

Rambaut i in., 2018

https://www.beast2.org/tracer-2/

SnpEFF v3.1

Cingolani i in., 2012

https://pcingola.github.io/SnpEff/download/

Oprogramowanie Proteome Discoverer 2.2.0.388

Termo Fischer

https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/spektrometria-masy/chromatografia-cieczowa-spektrometria-masy-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome- odkrywca-oprogramowanie.html

Zdeponowane dane

Dane aDNARV2039Y.pestis

To badanie

ENA: PRJEB42185,https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB42185

Dostępność zasobów

Główny kontakt

Dalsze informacje i prośby o zasoby i odczynniki należy kierować do głównej osoby kontaktowej, Ben Krause-Kyora ( b.krause-kyora@ikmb.uni-kiel.de ).

Dostępność materiałów

Badanie to nie wygenerowało nowych unikalnych odczynników.

Dostępność danych i kodu

Zbiory danych wygenerowane podczas tego badania są dostępne w Europejskim Archiwum Nukleotydów pod akcesyjnym PRJEB42185.

Model eksperymentalny i szczegóły przedmiotu

Antropologiczna kolekcja Rudolfa Virchowa

Ta kolekcja prehistorycznych i historycznych ludzkich czaszek, którą Rudolf Virchow (RV) zaczął montować w 1870 r., jest dziś przechowywana przez BGAEU. BGEAU-RV 1852 i BGEAU-RV 2039 to oficjalne etykiety pobierania próbek badanych w tym badaniu, zwane dalej RV 1852 i RV 2039.

Szczegóły metody

Analiza antropologiczna

Szczątki ludzkie zostały przebadane standardowymi metodami osteologicznymi (Brinker i in., 2018). Do analiz genetycznych pobrano zarówno kości skaliste, jak i zęby dla osobników RV 1852 i 2017/1; w przypadku 2018/1 pobrano kość skalistą, a w przypadku RV 2039 pobrano ząb.

Ekstrakcja i sekwencjonowanie aDNA

Wszystkie prace laboratoryjne zostały przeprowadzone w dedykowanej placówce aDNA. Ekstrakcja DNA z proszku kostnego/zębowego, dwuniciowy preparat biblioteki pół-UDG z unikalnymi kombinacjami indeksów dla każdej próbki i sekwencjonowania (Illumina HiSeq4000 (2×75 pz)) przeprowadzono zgodnie z ustalonymi protokołami (Krause-Kyora i in., 2018a; Rohland i in., 2015). Wygenerowane sekwencje zostały wstępnie przetworzone (przycinanie adaptera, scalanie i przycinanie) za pomocą oprogramowania Clip and Merge z domyślnymi parametrami (Peltzer i in., 2016).

Analizy genetyczne Yersinia pestis

Korzystanie z oprogramowania MALT z parametrami opisanymi w Krause-Kyora i in., 2018b oraz Susat i in., 2020 wszystkie próbki zostały przebadane pod kątem obecności patogenów wirusowych i bakteryjnych (Herbig i in., 2016). Odczyty Y. pestis – pozytywnej próbki RV 2039 zostały następnie zmapowane do genomu Y. pestis i jego trzech plazmidów (NC_0031431.1; NC_003131.1; NC_003134.1; NC_003132.1) za pomocą BWA (Li i Durbin, 2009). MapDamage 2.0 został użyty do przeskalowania uszkodzeń terminali, które pozostały po przygotowaniu biblioteki w połowie UDG (Jónsson i in., 2013). Kolejne generowanie plików VCF zostało wykonane zgodnie z opisem w Susat i in., 2020; Tabela S1). VCF zostały wygenerowane dla RV 2039, jednego szczepu Y. pseudotuberculosis i 276 innych szczepów Y. pestis (Bos i in., 2011, Bos i in., 2016; Cui i in., 2013; Damgaard i in., 2018; Eppinger i in., 2010; Eroszenko i in., 2017; Feldman i in., 2016; Keller i in., 2019; Kislichkina i in., 2015, Kislichkina i in., 2017, Kislichkina i in., 2018a, Kislichkina i in., 2018b; Kutyrev i in., 2018; Parkhill i in., 2001; Spyrou i in., 2016, Spyrou i in., 2019; Zhgenti i in., 2015). MulitiVCFAnalyzer został użyty do wygenerowania dopasowania zawierającego tylko pozycje informacyjne filogenetycznie z co najmniej 3-krotnym pokryciem i wsparciem alleli co najmniej 90% sekwencji (Bos i in., 2014). Aby poprawić rozdzielczość wizualną, z otrzymanego pliku odfiltrowano warianty specyficzne dla Y. pseudotuberculosis, które następnie wykorzystano do analizy filogenetycznej.RAxML został wykonany z modelem GTRgamma i 1000 bootstrapów (Stamatakis, 2014). MrBayes został wykonany z modelem GTR i 5.000.000 generacji (Huelsenbeck i Ronquist, 2001).

Spotkania molekularne

Podzbiór 41 reprezentatywnych genomów Y. pestis i RV 2039 zastosowano do wygenerowania dopasowania opartego na SNP za pomocą MultiVCF-Analyzer (Tabela S1; Rascovan i in., 2019; Susat i in., 2020). W oparciu o to dopasowanie obliczyliśmy ukorzenione drzewo największej wiarygodności (ML) z RAxML i 100 bootstrapami i użyliśmy TempEst do weryfikacji sygnału czasowego (współczynnik korelacji 0,57 (R2 = 0,32) (Rambaut i in., 2016). R zastosowano do wykreślenia danych TempEst i obliczenia 95% przedziału ufności (Osobnik S1). Powstałe drzewo zostało wykorzystane jako drzewo startowe dla BEAST2 w wersji 2.6 (Bouckaert i in., 2019). Analiza datowania podążała za poprzednimi pracami przy użyciu nieskorelowanego zegara zrelaksowanego z rozkładem log-normalnym i modelu substytucji GTR+G4 (Bouckaert i in., 2019; Rascovan i in., 2019). Ponadto założono koalescencyjną stałą liczebność populacji. Daty opublikowane dla poprzednich historycznych genomów Y. pestis zostały przekształcone w BP przez ustawienie roku 1950 jako wieku 0 (ze średnią jako wiek i granice jako przedział dla wcześniejszego jednolitego rozkładu). W BEAST2 wykonano dwa różne przebiegi. Jeden przebieg, w którym zapewniono drzewo początkowe RAxML i BEAST2 mógł zmienić drzewo, a drugi, w którym nie podano drzewa początkowego. Połączono wiele wersji z tego samego przebiegu, a dane po wypaleniu zwizualizowano za pomocą programu Tracer w wersji 1.7.1 (Rambaut i in., 2018). Wszystkie wartości efektywnej wielkości próby (ESS) były co najmniej większe niż 250 (Osobnik S2). LogCombiner i TreeAnnotator firmy BEAST2 zostały użyte do połączenia plików wynikowych i wygenerowania drzew o maksymalnej wiarygodności kladu.

Efekt SNP i analiza czynników wirulencji

V por. plik został użyty przez SnpEFF do adnotacji SNP (Cingolani i in., 2012). RV 2039 miał 106 unikalnych SNP z pokryciem >3x i wsparciem 80% odczytów (Tabela S2). Pokrycie genów wirulencji obliczono i wykreślono za pomocą programu Gnuplot w wersji 5.2.

Analizy genetyczne populacji ludzkiej

Mapowanie odczytów, genotypowanie SNP, określanie płci genetycznej, szacowanie skażenia, analiza głównych składowych, DOMIESZANIE, statystyki obcych grup f3 i qpADM zostały przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem (Immel i in., 2020; Rysunek S4).

Analiza proteomiczna

Przygotowanie próbki do oddolnej analizy LC-MS/MS

Po dodaniu 500 µl 0,5 M EDTA w wodzie MilliQ, sproszkowaną próbkę zęba (50 mg) homogenizowano za pomocą tłuczka do peletek i inkubowano przez noc w 20°C w celu demineralizacji macierzy kostnej i ekstrakcji białek. Próbkę następnie wirowano przez 5 minut w 20°C i 14000 g w celu zebrania supernatantu (frakcja EDTA), który przechowywano na lodzie. Osad ponownie zawieszono w 300 µl buforu do lizy (4% SDS, 0,1 M ditiotreitol (DTT), 0,1 M Tris-HCl), homogenizowano za pomocą tłuczka do peletek i inkubowano przez 10 minut w 95°C w celu dalszej demineralizacji i redukcji. Następnie próbkę schładzano i wirowano przez 5 minut w 20°C i 14000 gw celu zebrania supernatantu (frakcja SDS).

Aby zredukować wiązania dwusiarczkowe (frakcja EDTA i SDS), dodano 75 µl buforu redukcyjnego (0,2 M DTT w 50 mM wodorowęglanie amonu (ABC), 5% acetonitryl (ACN)) i inkubowano przez 30 minut w 60°C , a próbka została schłodzona przed alkilowaniem. W celu alkilowania obie frakcje inkubowano przez 20 minut w ciemności z 75 µl 0,8 M roztworu jodoacetamidu (IAA) w 50 mM ABC, 5% ACN.

Trawienie trypsyną przeprowadzono przy użyciu protokołu do przygotowania próbki w jednym naczyniu, wzmocnionego w fazie stałej (SP3). Zapas kulek przygotowano przez dodanie 110 µl hydrofilowych kulek do tej samej liczby kulek hydrofobowych, które są dostarczane w 0,05% roztworze azydku. Po trzykrotnym przemyciu 1,1 ml wody MilliQ i zebraniu kulek za pomocą magnesów, dodano 550 μl wody MilliQ w celu uzyskania końcowego stężenia kulek 20 mg/ml. Do frakcji EDTA dodano 750 μl etanolu (96%) i 50 μl roztworu perełek, a do frakcji SDS dodano 450 μl etanolu (96%) i 50 μl roztworu perełek. Obydwa delikatnie wymieszano przez lekkie kołysanie i inkubowano przez 18 minut w temperaturze pokojowej. Supernatant następnie usunięto ostrożnie za pomocą magnesu i próbki przemyto 3 razy 150 µl 80% etanolu w celu usunięcia zanieczyszczeń i soli z poprzednich etapów. Dodano 150 µl buforu do trawienia (50 mM ABC) i 10 µl trypsyny 40 ng/µl (o jakości do sekwencjonowania, Promega). Trawienie odbywało się przez noc w 37°C. Supernatant zebrano za pomocą magnesu, a roztwór peptydu oczyszczono za pomocą domowych końcówek etapu C18. Końcówki stolika kondycjonowano najpierw 150 µl metanolu, drugi 150 µl 80% ACN, 0,5% kwas octowy i trzeci 150 µl 0,5% kwas octowy. Następnie próbki ładowano na końcówki stolika i przemywano 150 µl 0,5% kwasu octowego. Elucję przeprowadzono przez dodanie najpierw 40 µl 40% ACN, 0,5% kwasu octowego, 40 µl 60% ACN, 0,5% kwasu octowego i dwukrotne dodanie 40 µl 80% ACN, 0,5% kwasu octowego.

Analiza LC-MS/MS

Próbki ponownie zawieszono w 15 µl buforu obciążającego (3% ACN, 0,1% TFA). Rozdział chromatograficzny przeprowadzono na układzie Ultimate 3000 UHPLC (Thermo, Dreieich, Niemcy) wyposażonym w kolumnę Acclaim PepMap C18 2UM 75UMx500MM NV FS (Thermo, Dreieich, Niemcy) sprzężoną online ze spektrometrem masowym. Zastosowano następujące eluenty A: 0,05% kwas mrówkowy i B: 80% ACN, 0,04% kwas mrówkowy. Początkowe warunki chromatograficzne były izokratyczne 4% B przez 2 minuty, po których następowały różne gradienty odpowiednio dla frakcji EDTA i SDS, ponieważ piki w serii EDTA eluują później niż piki w serii SDS.

Frakcja EDTA: od minuty 2 do 92 (eluent B 5% do 50%), od minuty 92 do 97 (eluent B 50% do 95%), od minuty 97 do 107 (eluent B 95%) i od minuty 107 do 120 (eluent B 5%).

Frakcja SDS: od minuty 2 do 30 (eluent B 10% do 30%), od minuty 30 do 92 (eluent B 30% do 55%) i od minuty 92 do 97 (eluent B 55% do 95%).

Zastosowano stałą szybkość przepływu 300 nl/minutę i wstrzykiwano 5 µl próbki na przebieg.

Separacja LC była sprzężona online ze spektrometrem masowym Orbitrap Fusion Lumos (Thermo, Dreieich, Niemcy) wykorzystując aktywację jonów HCD przy energii zderzenia 30%. Przeprowadzono pełną akwizycję MS (rozdzielczość 120000) z kolejnymi MS/MS zależnymi od danych (rozdzielczość 30000) z czasem cyklu 3 s. Pliki danych MS zostały przeszukane w zestawie baz danych FASTA zawierających ludzkie białka (pobieranie Uniprot 2019/03/13), białka Y. pestis (Pobierz Uniprot 2019/03/14) oraz listę cRAP powszechnych zanieczyszczeń laboratoryjnych. Wyszukiwania przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Proteome Discoverer (wersja 2.2.0.388) i algorytmu wyszukiwania SequestHT. Zastosowano współczynnik fałszywego wykrywania (FDR) dla peptydów i białek od 0,01 (ścisły) do 0,05 (zrelaksowany). Dopuszczalne były maksymalnie dwa pominięte miejsca cięcia, tolerancja masy prekursora 10 ppm i tolerancja masy fragmentów 0,02 Da. Modyfikacje dynamiczne: utlenianie (M, P); deamidacja (N, Q). Modyfikacja statyczna: karbamidometylacja (C). Zidentyfikowane peptydy zostały dodatkowo zbadane algorytmem PepQuery (Wen i in., 2019).

Podziękowanie

Badanie to zostało sfinansowane przez projekt Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) nr. 290391021 – CRC 1266 oraz w ramach niemieckiej strategii doskonałości EXC 2167–390884018 i EXC 2150–390870439 . Badania antropologiczne i archeologiczne nad Riņņukalns są częścią projektu „Riņņukalns, ein neolithischer Süsswassermuschelhaufen im Norden Lettlands und seine Bedeutung für die steinzeitliche Kulturentwicklung im östlichen Baltikum” finansowanego przez projekt nr 3 DFG (67) Łotwa „Letonica, diaspora i komunikacja międzykulturowa” ( ZD2015/AZ85 ). Dziękujemy Berlińskiemu Towarzystwu Antropologii, Etnologii i Prehistorii za możliwość ponownego zbadania czaszek i pobrania niezbędnych próbek do analiz.

Autorskie Wkłady

BK-K., HL i VB opracowali pomysł na to badanie. AM, IZ, GG, MK, EP-G., BT i MT dostarczyły szczątki ludzkiego szkieletu. UB, BT, MT, GG, EP-G. i JM przeanalizowali i datowali ludzkie szczątki. BK-K. a AF wygenerowało dane aDNA. JS, AI i BK-K. przeanalizował dane aDNA. AT i BS przeanalizowali starożytne dane dotyczące białek. AN, JS, CA, HL, US, IZ, VB, S.Sch. i BK-K. zinterpretowała wyniki. AN, JS, HL i BK-K. napisał manuskrypt z wkładem wszystkich innych autorów.

Deklaracja interesów

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Informacje o artykule

Historia publikacji

Opublikowano: 29 czerwca 2021

Przyjęto: 28 maja 2021

Otrzymano w zmienionej formie: 18 grudnia 2020 r.

Otrzymano: 21 września 2020 r.

Identyfikacja

DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109278

prawa autorskie

© 2021 Autorzy.

Licencja użytkownika

Uznanie autorstwa Creative Commons (CC BY 4.0) |

Uznanie autorstwa Creative Commons (CC BY 4.0)1|

1Julian Susat, Harald Lubke, Aleksander Immel, Valdis Bērziņš, Almut Nebel, Ben Krause Kyora, 5000-letni myśliwy-zbieracz już nękany przez Yersina pestis, https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)00645-8?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2211124721006458%3Fshowall%3Dtrue#%20

[Zamieszczając dziś w „WOBEC” załączony powyżej artykuł postanowiłem podzielić się z Państwem kilkoma przemyśleniami. Na tekst ten trafiłem w Internecie pracując nad książką (jej pierwszą częścią) „Człowiek wobec zarazy – Dżuma”. Pracuję nad nią już od prawie trzech lat i jest to kolejna wersja. Początkowo chciałem pisać o wszystkich chorobach zakaźnych jednocześnie, później tylko o kilku z nich, wreszcie wybrałem tylko jeden z punktów spojrzenia na ich dzieje. Będąc z zainteresowania głównie historiozofem interesuje mnie bowiem wpływ tych chorób na nasze dzieje i w nich nasze zachowania, postawy. Dziś historiozof nie może ograniczać się w swym poznaniu tyko do powstałych wcześniej prac historycznych, czy wcześniejszych historiozofii. Te bowiem są dziś, co najwyżej, tylko świadectwem naszej wiedzy i świadomości w danym okresie historycznym. Postęp naszej wiedzy jest tak ogromny, że nie sposób nawet ograniczyć naszego poznania do jednej dziedziny, by wiedzieć choćby o niej „wszystko”. Jeszcze w czasach oświecenia jeden z myślicieli mógł stwierdzić, że lepiej wiedzieć coś o wszystkim, niż wszystko o jednym, dziś nawet to jest niemożliwe.

Zamieszczony w „WOBEC” tekst ukazuje, że nasza wiedza w tej dziedzinie nauki wzrasta niemal z dnia na dzień. To zresztą tylko jedna z dziedzin. Tak też jest w wulkanologii (choć nauka, którą określiłbym mianem wulkanologia historyczna stawia dopiero pierwsze kroki), geologii itd., itp. Dzisiejszy badacz historii chcąc zrozumieć jej trendy, kierunki rozwoju musi choćby próbować ogarnąć wszystkie te dziedziny, nie zaniedbując oczywiście badań politologicznych i stricte historycznych. Musi też mieć świadomość, że jego badania mogą doprowadzić tylko do postawienia pewnych hipotez, które wciąż będą weryfikowane.

Moje badania doprowadziły mnie do postawienia hipotezy o jedności cywilizacji, która rozwijała się w ramach określonych struktur (głównie państw) i w której czynnikami regresu był głównie rozpad tych struktur (w wyniku wojen lub rewolucji), a także hipoteza jedności naszego gatunku. Tę drugą hipotezę postawiłem już bardzo dawno, dziś coraz dobitniej dowodzi jej prawdziwości genetyka. Myślę też, że udało mi się zrozumieć przyczyny ewolucji ustroju w ramach państwowości, znaleźć też odpowiedź na kilka innych pomniejszych zagadnień.

Wciąż się uczę, popełniam błędy… ale też wciąż rośnie mój optymizm. Choćby dzisiejszy artykuł. To praca zbiorowa. Odkrycia ostatnich lat, a dostępne dla każdego niemal z dnia na dzień. Mało tego, autorzy tych odkryć dzielą się nimi z nami nieodpłatnie. Nie trzeba nawet znać języka w jakim dane myśli zostały wyrażone. Tłumacz Google jest coraz lepszy, poprawiany przez miliony użytkowników z czasem będzie prawie doskonały…

Jedyne czego nam trzeba, to odrobinę pokory i pracowitości. Z czasem nasza wiedza będzie coraz większa. Myślę też, że znajdę wsparcie dla mojej idei zbudowania społecznościowego portalu „Dzieje”, który będą mogły redagować miliony jego użytkowników, by wspólnie napisać, a może lepszym słowem będzie pisać, więc…, byśmy wspólnie mogli pisać naszą historię, która nigdy się nie skończy. Tak długo, jak długo będą żyli ludzie, tak długo będzie powstawała ich historia.

                       Piotr Kotlarz]