Strategie terapeutyczne dla autyzmu: ukierunkowanie na trzy poziomy centralnego dogmatu biologii molekularnej / Derek Hong i Lilia M. Iakoucheva 

Zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD) to zaburzenie neurorozwojowe (NDD), które charakteryzuje się trzema podstawowymi objawami: deficytami w interakcjach społecznych i komunikacji, rozwojem języka oraz restrykcyjnymi i powtarzalnymi zachowaniami. U dużej części dzieci, u których zdiagnozowano ASD, występują dodatkowe objawy, w tym deficyty poznawcze, opóźnienie rozwoju, stany lękowe i inne choroby współistniejące z zaburzeniami nastroju i zaburzeniami psychicznymi [ 1 , 2 ]. Według stanu na rok 2021 CDC szacuje, że u 1 na 44, czyli ~2,3% dzieci w Stanach Zjednoczonych, zdiagnozowano ASD [ 3 ].

Z szacunków wynika, że ​​70% osób z ASD ma ograniczoną zdolność do samodzielnego życia [ 4 ]. Ta trwająca całe życie zależność od opiekunów, a także związane z ASD deficyty społeczne, poznawcze i behawioralne mogą przyczyniać się do stresu rodziców, prowadząc do zwiększonej liczby rozwodów wśród rodziców dzieci, u których zdiagnozowano ASD [ 5 ]. Na poziomie finansowym przewidywany koszt zasobów potrzebnych do opieki nad osobami z ASD będzie stopniowo wzrastał do 5,54 biliona dolarów rocznie do 2060 r. ze względu na koszty edukacji specjalnej, utratę produktywności spowodowaną nieformalną opieką i zwiększone korzystanie z usług opieki zdrowotnej [ 6 ]. Biorąc pod uwagę powszechność diagnozy, stres rodzinny i obciążenie finansowe społeczeństwa, konieczne jest opracowanie i udoskonalenie technik łagodzenia objawów społecznych, poznawczych i behawioralnych w ASD.

Powszechnie wiadomo, że ASD ma silne podłoże genetyczne. Wcześniejsze badania wykazały, że u bliźniąt jednojajowych występuje znacznie większa zgodność pod względem ASD niż u bliźniąt dwuzygotycznych, a odziedziczalność ASD szacuje się na 83% [ 7 ]. Chociaż osoby z niektórymi przyczynami monogenowymi, takimi jak zespół Angelmana (AS), zespół łamliwego chromosomu X (FXS) i zespół Retta (RTT) [ 8 , 9 , 10 ], mają cechy ASD, etiologia ASD jako całości jest niezwykle heterogeniczny [ 11 , 12 ]. Wcześniejsze badania zidentyfikowały rzadkie de novo i odziedziczone warianty liczby kopii (CNV) jako główne czynniki zwiększające ryzyko ASD [ 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 ]. Następnie sekwencjonowanie całego egzonu (WES) rodzin prostych z jednym chorym dzieckiem wykazało silny związek rzadkich wariantów pojedynczych nukleotydów eksonowych de novo (SNV) z ASD [ 20 , 21 , 22 , 23 , 24 ], przy czym nowsze analizy podkreślają około stu genów ryzyka ASD istotnych dla całego genomu [ 25 , 26 ]. Dla podzbioru genów, które znacznie przekroczyły znaczącą wartość odcięcia dla całego genomu (co najmniej FDR < 0,05), takich jak KMT2E , ANKRD11 , ARID1B , CHD8 , PTEN, SHANK3, DYRK1A i CUL3 , modele mysie opracowano w ciągu lata [ 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ]. Ponadto ustalono modele naczelnych innych niż ludzie (NHP) dla genów MECP2 (związanych z RTT) i SHANK3 u makaków cynomolgus ( Macaca fascicularis ), aby lepiej podsumować punkty czasowe rozwoju człowieka [ 35 , 36 ]. Modele te dodatkowo sugerują, że heterozygotyczne mutacje powodujące utratę funkcji (LoF) (znane również jako haploinsufficiency) w tych genach są odpowiedzialne za określone fenotypy neurobiologiczne i behawioralne zwierząt. Oprócz rzadkich wariantów de novo, w niedawnym badaniu asocjacyjnym obejmującym cały genom (GWAS) zidentyfikowano 5 loci ASD istotnych dla całego genomu [ 37] Biorąc pod uwagę tak ekstremalną heterogeniczność genetyczną i jednoznaczną rolę genów dotkniętych LoF (i często haploinsuficientnych) w etiologii ASD, bezcenne będzie odejście od badań opartych na identyfikacji i przystąpienie do badania technik terapeutycznych, które mogłyby zwiększyć ekspresję tych genów .

Interwencje terapeutyczne w ASD mające na celu ratowanie haploinsufficiency poszczególnych genów można opracować tak, aby były ukierunkowane na wszystkie trzy poziomy centralnego dogmatu biologii molekularnej: DNA, mRNA i białko ( ryc. 1 ) . Przykłady takich interwencji obejmują edycję genomu za pomocą CRISPR na poziomie genetycznym, oligonukleotydy antysensowne (ASO) zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i potranskrypcyjnym, a także zastosowanie leków drobnocząsteczkowych do celowania w szlaki molekularne na poziomie translacji lub białka. W tym przeglądzie przeanalizujemy zalety i wady różnych technik w ramach głównego dogmatu w celu ratowania fenotypów związanych z ASD.

Na rysunku przedstawiono leki liniowo w oparciu o naturalny postęp ekspresji genów. W pierwszej kolumnie leki małocząsteczkowe i terapie oparte na CRISPR są zwykle opracowywane w celu leczenia chorób na poziomie DNA. W drugiej kolumnie oligonukleotydy antysensowne (ASO) są zwykle opracowywane w celu leczenia chorób na poziomie mRNA. W trzeciej kolumnie leki małocząsteczkowe są zwykle opracowywane w celu leczenia chorób na poziomie białek. W całym przeglądzie opisano konkretne przykłady każdego z tych środków terapeutycznych.

Terapia genowa obejmuje techniki, które mogą zmienić ekspresję genów organizmu poprzez celowanie w DNA poprzez dostarczenie transgenu lub bezpośrednią modyfikację genomu, w celu terapeutycznego przywrócenia normalnego poziomu ekspresji genu ulegającego patologicznej ekspresji [ 38 ].

Dostarczanie transgenu

Dostarczenie transgenu jest metodą terapii genowej, którą można zastosować w celu skorygowania haploinsuficiencji spowodowanej mutacjami LoF [ 39 ]. Zastosowano go w leczeniu kilku NDD, dla których znana jest przyczyna monogenowa. RTT to NDD mieszczące się w klasyfikacji ASD [ 40 , 41 ]. Podczas gdy LoF genu białka wiążącego metylo-CpG 2 ( MECP2 ) jest przyczyną RTT, duplikacja MECP2 powoduje zespół duplikacji MECP2 (MDS) [ 10 , 42 ]. Wykazano, że możliwe jest zmniejszenie ciężkości RTT poprzez dostarczenie transgenu Mecp2 w mysim modelu Mecp2-null [ 43 ]. Jednakże, biorąc pod uwagę czułość dawkowania genu MECP2 , przed translacją kliniczną konieczne jest właściwe określenie dawki. Nowsze badanie wykazało, że dostarczenie podatnej na niestabilność kasety transgenu Mecp2 ( iMecp2 ) przy użyciu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) objawowym myszom z mutacją Mecp2 znacząco poprawiło aktywność lokomotoryczną, długość życia i normalizację ekspresji genów [ 44 ].

Zespół łamliwego chromosomu X, kolejna NDD, która charakteryzuje się między innymi niepełnosprawnością intelektualną (ID), często współistnieje z ASD i jest wynikiem mutacji ekspansji powtórzeń tripletowych CGG w genie upośledzenia umysłowego łamliwego X 1 ( FMR1 ), która wycisza produkcję kodowanego przez niego białka FMRP [ 45 , 46 ]. W jednym badaniu wykorzystano dostarczanie transgenu nierozszerzonej kopii genu FMR1 przy użyciu wektora AAV wstrzykniętego bezpośrednio do mózgów myszy Fmr1 ^-/- , co skutecznie uratowało myszy o powtarzających się fenotypach behawioralnych, społecznych i napadowych [ 47 ]. Poza kontekstem NDD FDA zatwierdziła Luxturnę – terapię transgenową mającą na celu dostarczenie genu RPE65 do siatkówki i skuteczną terapię rzadkiej dziedzicznej choroby siatkówki, która powoduje zaburzenia widzenia i ślepotę [ 48 , 49 ]. Biorąc pod uwagę zgodę Luxturny i sukcesy w dostarczaniu transgenów dla modeli myszy RTT i FXS, mechanizm ten może mieć wartość dla innych genów LoF związanych z ASD. Należy jednak pamiętać, że terapeuci NDD mogą napotkać w klinice więcej przeszkód niż podawanie leku Luxturna do siatkówki, ponieważ mózg jest trudniej dostępny niż oko i wymaga, aby wektor dostarczania przekroczył barierę krew-mózg (BBB). Co więcej, mózg jest bardziej złożonym organem, charakteryzującym się większą złożonością typów komórek i znacznie różniącymi się poziomami ekspresji genów pomiędzy każdym typem, co sprawia, że ​​specyficzność komórkowa stanowi dodatkowy problem w terapii NDD [ 50 ].

Modyfikacje za pośrednictwem CRISPR

W ciągu ostatniej dekady pojawienie się inżynierii genomu za pomocą CRISPR-Cas9 zrewolucjonizowało terapię genową, otwierając nową drogę terapeutyczną opartą na modyfikacjach na poziomie DNA. CRISPR-Cas9 to konstrukt składający się z kierującego RNA (gRNA), który celuje w interesujące loci genetyczne oraz enzymu endonukleazy Cas9, który działa jak para nożyczek nukleotydowych, które przecinają DNA w miejscu docelowym, skutecznie tworząc dwuniciowy Przerwa w DNA w celu późniejszej edycji genomu [ 51 ]. Wyjątkowa zdolność kierowania Cas9 do dowolnej lokalizacji w genomie otworzyła nowe możliwości celowanej terapii genowej.

Jedną z możliwości wykorzystania inżynierii genomu do regulacji ekspresji genów jest skierowanie jej na naturalne transkrypty antysensowne (NAT) [ 52 ]. NAT ulegają endogennej ekspresji zarówno w organizmach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. W układach eukariotycznych NAT mogą wywierać dwukierunkowy wpływ regulacyjny na transkrypcję genów docelowych, albo tłumiąc, albo wzmacniając translację mRNA genu docelowego [ 53 , 54 ]. Hamowanie ekspresji docelowego genu może zachodzić poprzez różne mechanizmy, takie jak interferencja RNA po utworzeniu dupleksu sensownego-antysensownego mRNA, interferencja transkrypcyjna, w której NAT może działać jako fizyczna bariera dla aktywności polimerazy RNA lub epigenetyczna metylacja sensu genu DNA, hamując w ten sposób transkrypcję sensownego transkryptu mRNA [ 55 , 56 ]. Chociaż wiele NAT ma hamującą kontrolę nad ekspresją swoich komplementarnych genów, istnieją pewne przypadki, w których NAT mogą bezpośrednio zwiększać sensowną ekspresję genów [ 57 ]. Proponuje się, że NAT mogą zwiększać ekspresję docelowego genu poprzez zwiększanie stabilności sensownego mRNA lub modyfikacje epigenetyczne związane z euchromatyną [ 54 ]. Umieszczając to w kontekście terapeutycznym, możliwe może być przywrócenie ekspresji genów ryzyka ASD, które mają mutacje LoF, poprzez ukierunkowaną supresję odpowiednich hamujących NAT.

Strategię tę ostatnio zastosowano w leczeniu zespołu Angelmana (AS), choroby NDD, której przyczyną może być mutacja LoF w matczynej kopii allelu UBE3A [ 58 , 59 ]. Ponieważ ojcowska kopia UBE3A jest zwykle nieaktywna, badanie hamowania UBE3A NAT ma wartość terapeutyczną. Odnotowano sukces w ratowaniu haploinsufektywności genu UBE3A poprzez hamowanie transkrypcji UBE3A NAT za pośrednictwem CRISPR-Cas9 u myszy – skutecznie przywracając ekspresję UBE3A poprzez reaktywację kopii ojcowskiej [ 58 , 60 ]. W kontekście FXS, zamiast celować w NAT genu FMR1 , udało się przywrócić ekspresję FMR1 w indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (iPSC) poprzez bezpośrednią delecję patologicznych sekwencji powtórzeń sensownego genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 [ 61 ] .

Poza kontekstem NDD, obecnie podejmuje się próby zastosowania CRISPR-Cas9 do leczenia wrodzonej ślepoty Lebera 10 (LCA10). LCA10 to ciężka postać dystrofii siatkówki spowodowana mutacją punktową adeniny do guaniny w intronie 26 ludzkiego genu CEP290 (IVS26), co skutkuje włączeniem tajemniczego egzonu i przedwczesnego kodonu stop [ 62 ]. Aby celować w LCA10, w jednym badaniu opracowano lek o nazwie EDIT-101, który składa się z Cas9 i konstruktu gRNA upakowanego w serotypie 5 AAV (AAV5) w celu wprowadzenia delecji lub inwersji w zmutowanym regionie intronu 26 [ 63 ]. W mysim modelu ludzkiego CEP290 IVS26, EDIT-101 wykazywał dużą wydajność edycji w komórkach fotoreceptorów, skutecznie przywracał prawidłowy splicing mRNA CEP290 i przywracał produkcję białka CEP290 pełnej długości [ 63 ]. Na poziomie klinicznym EDIT-101 jest pierwszym zastosowaniem edytora genomu w OUN i obecnie znajduje się w fazie 1/2 badań klinicznych z udziałem pacjentów dorosłych i dzieci ( https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03872479 ).

Zmodyfikowana aktywacja CRISPR

Wykorzystując jako podstawę tradycyjny kompleks CRISPR-Cas9, opracowano zmodyfikowaną wersję, w której enzym Cas9 jest nieaktywny lub „martwy” (dCas9) [ 64 ]. Chociaż zdolność dCas9 do cięcia za pośrednictwem endonukleazy staje się nieaktywna, enzym może nadal wiązać się, umożliwiając specyficzne ukierunkowanie w obrębie genomu. Ten system dCas9 można połączyć z aktywatorami transkrypcji (ryc. 2A ) w celu zwiększenia ekspresji genów bez wywoływania pęknięcia dwuniciowego DNA – procesu znanego jako aktywacja za pośrednictwem CRISPR (CRISPRa) [ 65 , 66 , 67 ] (Rys. 2B ). Aby CRISPRa zadziałała, RNA o pojedynczym przewodniku (sgRNA) zaprojektowano tak, aby celowało w regiony od 1 do 1000 bp powyżej miejsca startu transkrypcji (TSS) w regionie promotora genu docelowego. Gdy sgRNA zwiąże się z tym regionem, rekrutowany będzie dCas9 połączony z odpowiednimi aktywatorami transkrypcji.

CRISPRa wykorzystuje katalitycznie martwy Cas9 (dCas9) połączony z różnymi aktywatorami transkrypcji.

Przedstawienie najpowszechniejszych aktywatorów transkrypcji (TA) połączonych z dCas9: (i) Tradycyjny VP64, (ii) Kombinacja VP64, p65 i Rta (VPR), (iii) System synergistycznego mediatora aktywacji (SAM) składający się p65, HSF1 i MS2 oraz (iv) system Suntag składający się z dCas9 połączonego z łańcuchem polipeptydowym, w którym fuzja przeciwciała VP64-GCN4 jest związana z każdym peptydem – umożliwiając rekrutację wielu kopii VP64. B Mechanizm działania CRISPRa. Po naprowadzeniu przez konstrukt sgRNA do regionu promotora, 1 do 1000 bp powyżej miejsca startu transkrypcji (TSS) genu docelowego, dCas9-VPR będzie sprzyjał wzrostowi transkrypcji. Zmniejszenie ekspresji mRNA w prawej kolumnie jest wynikiem nieleczonego genu Haploinsufficient. Skróty : Aktywator transkrypcji TA, Transaktywator Rta wirusa Epsteina-Barra R, MS2 – białko płaszcza bakteriofaga, ludzki czynnik szoku cieplnego 1 HSF1, przeciwciało GCN4Ab GCN4.

Możliwe jest modulowanie wielkości aktywacji poprzez zmianę, które z białek jest połączone z dCas9 (ryc. 2A ). Po fuzji z C-końcem dCas9 aktywator transkrypcji VP64 powoduje umiarkowany wzrost ekspresji genów [ 68 ]. Opierając się na tej początkowej fuzji VP64, kombinacyjna fuzja VP64, p65 i Rta (VPR) z C-końcem dCas9 powoduje znacznie wyższą aktywację transkrypcji, z wielkością efektu w zakresie od 22-krotnie do 320-krotnie większą niż sam VP64 [ 68 ] Stycznie, SunTag to kolejny system wykorzystujący VP64. Jednakże zamiast VP64 bezpośrednio połączonego z dCas9, Suntag składa się z dCas9 połączonego z łańcuchem polipeptydowym, w którym fuzja przeciwciała VP64-GCN4 jest związana z każdym peptydem, co pozwala na rekrutację wielu kopii VP64 do promotora genu [ 69 ] . Inną fuzją dCas9 jest system synergistycznego mediatora aktywacji (SAM), który składa się łącznie z trzech składników: dCas9 połączony z VP64 z sekwencją lokalizacji jądrowej (NLS) (NLS-dCas9-VP64), dwie domeny aktywacyjne (p65 i ludzki szok cieplny czynnik 1 (HSF1)) połączony z białkiem płaszcza bakteriofaga MS2 (MS2-p65-HSF1) i sgRNA połączony z dwoma aptamerami spinki do włosów nakierowanymi na białko MS2 w regionach łodyga-pętla 2 i tetraloop (sgRNA2.0) [ 70 ] .

Dla porównania, jedno badanie wykazało, że chociaż systemy VPR, Suntag i SAM wykazywały o wiele rzędów wielkości większą aktywację transkrypcji niż sam VP64, różnice między tymi trzema systemami wynosiły nie więcej niż jeden poziom [ 71 ]. Chociaż należy zauważyć, że różnice między VPR, Suntag i SAM zależą od typu komórki i są specyficzne dla genu. Co więcej, wszechobecne stosowanie silnego aktywatora transkrypcji w CRISPRa może nie być korzystne, ponieważ nadmierna aktywacja niektórych genów może wywołać niepożądane skutki. Na przykład w przypadku MECP2 korzystne może być wywołanie umiarkowanej aktywacji za pomocą tradycyjnego dCas9-VP64 zamiast silniejszych aktywatorów, ponieważ nadmierna aktywacja MECP2 może potencjalnie skutkować MDS. Opisany system CRISPRa został ostatnio zastosowany w kilku zwierzęcych modelach NDD.

Zespół Draveta jest chorobą NDD spowodowaną haploinsufficiencją kanału Na2 ⁺ bramkowanego napięciem SCN1A [ 72 , 73 ]. Poprzez celowanie w długi niekodujący RNA [ 74 ] lub region promotora genu SCN1A za pomocą CRISPRa [ 75 ], w badaniach pomyślnie zwiększono ekspresję SCN1A i przywrócono dysfunkcyjną pobudliwość neuronów i fenotypy napadów. Podobnie, haploinsufficiency kanału Na2 ⁺ bramkowanego napięciem SCN2A również powiązano z ASD [ 76,77 ] . W jednym z ostatnich badań wykorzystano CRISPRa do skutecznego przywrócenia pobudliwości neuronalnej i deficytów elektrofizjologicznych u myszy Scn2a ^+/- do poziomów typu dzikiego, przy czym efekt utrzymywał się odpowiednio przez co najmniej 3 i 8 miesięcy [ 78 ].

Poza kontekstem NDD, CRISPRa stosowano do celowania w kanał potasowy bramkowany napięciem KCNA1 w celu zapobiegania częstości napadów i dysfunkcji poznawczych w mysim modelu padaczki [ 79 ]. Na poziomie fenotypu fizjologicznego CRISPRa zastosowano również do zwiększenia transkrypcji genów ryzyka otyłości SIM1 i MC4R oraz do skutecznego ratowania haploinsufitowej otyłości w modelach mysich – a efekty utrzymywały się do 9 miesięcy po leczeniu [ 80 ]. Na poziomie ekspresji inne badanie wykazało, że CRISPRa skutecznie zwiększał ekspresję TTR u myszy transgenicznych dCas9-SAM 19 dni po leczeniu, ale efekt ten zmniejszył się w ciągu 8 miesięcy [ 81 ]. Z wyjątkiem tych badań, nadal nie ma wystarczających informacji na temat stopnia trwałości efektów terapii CRISPRa. Pomyślne tłumaczenie kliniczne wymaga dalszych badań in vivo, które oceniają znacznie późniejsze punkty czasowe.

Ukierunkowane hamowanie hamujących NAT lub aktywacja genu przy użyciu CRISPRa to przykłady strategii terapeutycznych dla NDD na poziomie DNA. Jednakże możliwa jest również regulacja ekspresji NAT na poziomie potranskrypcyjnym. Badając kolejny poziom regulacji, warto ocenić potencjał wykorzystania ASO, gdyż mogą one zwiększać ekspresję genów poprzez różne mechanizmy. Mechanizmy te można podzielić na dwie główne kategorie funkcjonalne: (a) zwiększenie poziomu genu sensownego poprzez bezpośrednie interakcje z transkryptem mRNA genu sensownego oraz (b) zwiększenie poziomu genu sensownego poprzez hamowanie NAT za pośrednictwem ASO.

Bezpośrednia regulacja w górę genu sensownego

Badając zdolność ASO do zwiększania poziomu genu sensownego poprzez bezpośrednią interakcję z mRNA genu sensownego, pierwszy mechanizm leży w ASO, które celują w otwarte ramki odczytu (uORF) transkryptu sensownego [ 82 ] ( ryc. 3 ) . uORF to region w nieulegającym translacji regionie 5′ (UTR) transkryptu mRNA, który często zawiera dodatkowy kodon start, jak również kodon stop [ 83 ]. Kiedy translacja zostanie zainicjowana w tym loci, może nastąpić spadek efektywności translacji białka w miejscu startu powyżej z powodu wytwarzania peptydu, który ostatecznie blokuje funkcję rybosomów [ 84,85 ] . Aby wykorzystać ten mechanizm regulacji genu, zaprojektowano ASO tak, aby specyficznie celowały w uORF genu Lrpprc w modelach mysich i odkryły, że leczenie skutecznie zwiększyło ekspresję białka LRPPRC, co dostarczyło dowodów na skuteczność tego mechanizmu [ 84 ] Jednakże potrzebne są dalsze badania, aby zbadać skuteczność celowania w uORF w modelach chorób, ponieważ wiele z tych badań raczej potwierdziło zasady niż wykazało sukces w modelach chorób.

ASO można zastosować do hamowania kodonu start powyżej w otwartej ramce odczytu (uORF) transkryptu mRNA w celu zwiększenia ekspresji translacyjnej genu docelowego; B ASO można stosować do celowania i hybrydyzacji z elementami hamującymi, które tworzą struktury drugorzędowe hamujące translację w obrębie uORF transkryptu mRNA, aby ostatecznie zwiększyć ekspresję translacyjną genu docelowego. Zmniejszenie ekspresji mRNA w skrajnej prawej kolumnie jest wynikiem nieleczonego genu haploinsuficient.

Po drugie, zamiast pośredniczyć w cięciu transkryptów mRNA, ASO można również zaprojektować tak, aby celowały i hybrydyzowały z elementami hamującymi w regionie 5’UTR transkryptu mRNA. Wykazano wcześniej obecność struktur drugorzędowych hamujących translację w obrębie 5′ UTR transkryptów mRNA [ 82 , 86 ], a zaprojektowanie ASO komplementarnych do tych regionów mogłoby potencjalnie złagodzić hamowanie translacji (ryc. 3 ).

Na przykład w jednym badaniu wykorzystano ASO do nakierowania na strukturę typu spinki do włosów w regionie 5′ UTR mRNA LDLR , która hamowała translację białka, co skutkowało wzrostem ekspresji białka LDLR i wychwytu LDL w komórkach HEK293T [ 82 ]. Podobne metody zastosowano w przypadku mukowiscydozy (CF), choroby charakteryzującej się znacznymi dysfunkcjami płuc i trzustki, będącej wynikiem mutacji w genie CFTR kodującym kanał Cl ^[ 87 ] . W komórkowym modelu CF zaprojektowano ASO tak, aby celowały w hamujące drugorzędowe struktury mRNA w uORF 5’UTR transkryptu mRNA CFTR – skutecznie zwiększając zarówno ekspresję, jak i funkcję CFTR [ 88 ]. Jednakże, chociaż sukces w modelu CF in vitro zapewnia potencjał do przełożenia klinicznego, potrzebne są dalsze dowody na sukces in vivo przy zastosowaniu tego specyficznego podejścia terapeutycznego.

Po trzecie, istnieją dowody na skuteczne przywrócenie nieprawidłowego splicingu mRNA w stanach mięśni niezwiązanych z NDD, takich jak rdzeniowy zanik mięśni (SMA) [ 89 ] i dystrofia mięśniowa Duchenne’a (DMD) [ 90 ] poprzez celowanie w połączenia splicingowe i elementy cis-regulacyjne za pomocą ASO [ 91 , 92 ] (ryc. 4A ). W SMA u poszczególnych osób brakuje działającej kopii genu SMN1 , dlatego ASO wykorzystuje się do ułatwienia prawidłowego splicingu genu SMN2 poprzez indukcję włączenia eksonu 7, co ostatecznie ratuje ekspresję białka SMN w modelach komórek ssaczych in vitro [ 91] . ]

Ryc. 4: Schemat mechanizmów regulacji alternatywnego splicingu przez oligonukleotydy antysensowne (ASO).

Inkluzja egzonu działa poprzez ukierunkowanie na połączenia splicingowe i elementy regulatorowe cis (CRE) jako forma alternatywnego splicingu transkryptu mRNA, tworząc w ten sposób funkcjonalną kopię białka. W tym przykładzie ASO celuje w tłumik intronowego splicingu (ISS); Pomijanie eksonu B jest formą regulacji alternatywnego splicingu, która polega na maskowaniu dysfunkcjonalnego eksonu za pomocą ASO, co skutkuje wycięciem eksonu z końcowego transkryptu mRNA. Pozwala to na przywrócenie ramki odczytu i translację częściowo funkcjonalnego białka.

W 2016 roku FDA zezwoliła na stosowanie Spinrazy, pierwszej terapii opartej na leku w leczeniu SMA [ 93 ]. Spinraza działa dzięki mechanizmowi ukierunkowanego włączenia eksonu 7 do mRNA SMN2, skutecznie ratując funkcje motoryczne u pacjentów [ 94 , 95 ]. W DMD mutacje w genie dystrofiny powodują przesunięcie ramki odczytu i prowadzą do wytworzenia niefunkcjonalnego białka dystrofiny [ 96 ]. ASO ukierunkowane na DMD są ukierunkowane na eksony niosące mutacje przesunięcia ramki odczytu odpowiedzialne za DMD. Zaprojektowane ASO maskują dysfunkcjonalny ekson w pre-mRNA, w wyniku czego ekson zostaje odłączony od końcowego transkryptu mRNA, przywracając w ten sposób ramkę odczytu i wytwarzając częściowo funkcjonalną kopię białka dystrofiny [ 92 , 97 ] (ryc. 4B ).

Chociaż we wczesnych stadiach badań klinicznych z zastosowaniem ASO Drisapersenu pomijającego egzony w leczeniu DMD pokładano wiele nadziei, badania fazy 3 nie przyniosły sukcesu klinicznego [ 98 , 99 , 100 ]. Jednak w 2016 r. FDA zezwoliła na stosowanie Eteplirsenu, ASO wywołującego pomijanie eksonów w celu ekspresji częściowo funkcjonującej dystrofiny, jako pierwszej terapii lekowej DMD [ 101 ]. Podobnie ASO promujący alternatywny splicing o nazwie Milasen został zaprojektowany jako spersonalizowany lek do leczenia osób cierpiących na chorobę Battena, chorobę neurodegeneracyjną charakteryzującą się ślepotą, zwiększoną podatnością na drgawki i opóźnieniem rozwoju [ 102 , 103 , 104 ]. Mutacja w genie MFSD8 (znanym również jako CLN7 ) spowodowała powstanie skróconego i dysfunkcyjnego białka, a leczenie Milasenem było w stanie skutecznie pomóc w leczeniu fenotypów napadów padaczkowych i poprawić wyniki neurologiczne, tymczasowo poprawiając jakość życia pacjenta [ 104 ].

Po czwarte, ASO mogą tłumić rozpad transkryptów mRNA za pośrednictwem nonsensu (NMD) poprzez celowanie w region kompleksu połączenia egzonu (EJC) zlokalizowany poniżej kodonów przedwczesnej terminacji transkryptu (ryc. 5A ). Mechanicznie NMD zależy od obecności co najmniej jednego EJC, a ukierunkowanie na ten szlak za pomocą ASO doprowadziło do wzrostu ekspresji genu MECP2 w modelach komórek ssaczych in vitro [ 105 ]. Dostarcza to dowodów na potencjalne wykorzystanie ASO do hamowania NMD MECP2 , otwierając w ten sposób drogę terapeutyczną w leczeniu zespołu Retta. Jednakże ponownie ważne jest, aby zwrócić uwagę na wrażliwość dawkowania MECP2 jako istotną przeszkodę na drodze do skutecznego leczenia. Ponadto potrzebne są dalsze badania w celu określenia idealnej dawki zapobiegającej indukcji MDS, a przed pomyślnym przełożeniem klinicznym na modele in vivo potrzebne są dalsze badania.

Ryc. 5: Schemat mechanizmów oligonukleotydów antysensownych (ASO) związanych z degradacją transkryptu mRNA.

ASO zapobiegają rozpadowi za pośrednictwem nonsensu (NMD) transkryptu mRNA poprzez hybrydyzację. Celując w region kompleksu połączenia egzonu (EJC) poniżej kodonów przedwczesnej terminacji transkryptu (PTC), ASO zwiększają stabilność transkryptu. Zapobiega to NMD i zwiększa ekspresję translacyjną genu docelowego; B ASO mogą indukować za pośrednictwem RNAzy H degradację naturalnego transkryptu antysensownego (NAT), aby złagodzić hamowanie sensownego transkryptu mRNA poprzez hybrydyzację. Enzym endonukleaza RNAza H rozpozna i rozszczepi dupleks ASO-NAT, umożliwiając w ten sposób niehamowaną translację odpowiedniego genu sensownego. Aktywacja allelu ojcowskiego UBE3A poprzez ASO ukierunkowane na UBE3A-AS (najbardziej prawa kolumna) jest konkretnym przykładem tego mechanizmu stosowanego w leczeniu zespołu Angelmana.

Regulacja w górę genu sensownego poprzez degradację NAT

Chociaż wspomniane wcześniej mechanizmy działają w celu zwiększenia ekspresji genu sensownego poprzez bezpośrednie oddziaływanie na transkrypt mRNA genu sensownego, jednym ograniczeniem jest fakt, że uORF występują jedynie w około 50% mRNA ssaków i w obrębie tych 50% nie wszystkie mają działanie hamujące [ 106 , 107 ]. Dlatego też regulacja w górę genów sensownych związanych z ASD poprzez degradację NAT za pośrednictwem ASO ma dużą wartość. Mechanicznie, gdy ASO zwiąże się z transkryptem mRNA NAT, enzym endonukleaza RNAzy H rozszczepi dupleks RNA, skutecznie tłumiąc funkcję hamującą tych NAT [ 59 , 108 ] (ryc. 5B ).

Jak omówiono wcześniej, zespół Draveta (DS) jest chorobą NDD spowodowaną haploinsufficiencją kanału Na2 ⁺ bramkowanego napięciem SCN1A [ 72 , 109 ]. Dzięki zastosowaniu ASO do ukierunkowania na SCN1A NAT w jednym badaniu udało się skutecznie uratować sensowną ekspresję genu SCN1A , złagodzić pobudliwość neuronów i drgawki w mysim modelu DS – efekt, który prawie całkowicie odzwierciedla uratowane fenotypy obserwowane podczas leczenia CRISPRa [ 74 , 75 ].

Podobnie zespół Angelmana (AS) jest chorobą NDD wynikającą z haploinsuficiencji genu UBE3A . Chociaż poprzednie sukcesy odkryto w ratowaniu opartym na CRISPR na poziomie DNA, możliwe jest również namierzenie transkryptu mRNA UBE3A NAT w celu degradacji na poziomie transkrypcji [ 60 ]. Liczne badania wykazały , że możliwe było zmniejszenie ekspresji UBE3A NAT, uratowanie sensownej ekspresji UBE3A oraz polepszenie fenotypów poznawczych i behawioralnych w mysim modelu AS poprzez degradację za pośrednictwem RNAzy [ 59,110 ]. Na poparcie tego mechanizmu eksperymentalne leki GTX-102 ( https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04259281 ), ION582 ( https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT05127226 ) i RO7248824 ( https: //clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04428281 ) wykorzystują ASO ukierunkowane na NAT i obecnie przechodzą badania kliniczne fazy 1/2 z udziałem dzieci i dorosłych pacjentów z AS. Należy jednak zauważyć, że badanie GTX-102 zostało tymczasowo wstrzymane ze względu na rozwój u pacjentów ostrej poliradikulopatii zapalnej w wyniku leczenia [ 111 ]. Donoszono, że poliradikulopatia nie była reakcją immunologiczną, ale prawdopodobnie wynikiem miejscowej toksyczności spowodowanej wysokim stężeniem GTX-102 w miejscu wstrzyknięcia [ 111 ]. Pomimo tych działań niepożądanych lek okazał się bardzo obiecujący, ponieważ wszyscy uczestnicy wykazali znaczną poprawę w zakresie funkcji motorycznych, komunikacji, snu i problemów behawioralnych.

Ukierunkowane terapie edytujące RNA

Poza terapeutykami opartymi na ASO, które działają głównie jako modulatory potranskrypcyjne, przyszłość może wiązać się z bezpośrednią edycją transkryptu mRNA. Przy pomocy Cas13, rybonukleazy kierowanej przez RNA, tradycyjnie stosowanej do skutecznego i specyficznego cięcia transkryptów mRNA, możliwe było opracowanie nowego białka fuzyjnego zdolnego do edycji transkryptu mRNA, znanego jako edycja RNA w celu programowalnej zamiany A na I (NAPRAWA). [ 112 ] Aby opracować REPAIR, ortolog Cas13b zmutowano tak, aby był katalitycznie martwym Cas13b (dCas13b) i połączono z deaminazą adenozynową działającą na enzym RNA 2 (ADAR2), co umożliwiło zastąpienie reszt adenozyny (A) resztami inozyny (I) w mRNA transkrypcje. Podobnie udowodniono, że fuzja enzymu dCas9 z ADAR2 powoduje te same modyfikacje A do I w mRNA z porównywalną wydajnością i specyficznością jak system REPAIR [ 113 ]. Opierając się na edycji RNA związanej z ADAR2, w jednym z ostatnich badań opracowano AAV, które koeksprymują ludzką domenę katalityczną ADAR2 typu dzikiego połączoną z peptydem λN bakteriofaga (Editase ^wt ) i RNA kierującym Mecp2 [ 114 ]. W badaniu wykorzystano system oparty na Editase ^wt do namierzenia mutacji Mecp2 ^G311A , która tworzy kodon stop, co skutkuje brakiem białka MeCP2. Wstrzyknięcie konstruktu pozaoczodołowego myszom z mutacją Mecp2 ^G311A skutecznie przywróciło ekspresję i funkcję białka MeCP2, wydłużyło przeżycie i poprawiło funkcję oddechową myszy. Chociaż te oparte na ADAR środki terapeutyczne do edycji RNA są wysoce specyficzne w dokonywaniu modyfikacji A do I w transkryptach mRNA, nadal zapewniają obiecującą alternatywną drogę terapeutyczną do klinicznej translacji środków terapeutycznych NDD.

W dalszej części głównego dogmatu biologii kluczowe podejście terapeutyczne polega na aktywacji lub hamowaniu szlaków molekularnych związanych z NDD. Skutecznie przesunęłoby to uwagę z terapii opartych na ekspresji na terapie potranslacyjne.

Szlaki proliferacyjne

Stwardnienie guzowate (TS) to choroba monogenowa charakteryzująca się dużą częstością występowania ASD, spowodowaną mutacjami LoF w genach TSC1 i TSC2 [ 115 ]. Mutacje te prowadzą do nadmiernej aktywacji szlaku mTOR, co ostatecznie prowadzi do powstania łagodnych nowotworów w wielu narządach [ 116,117 ] . Badania na myszach wykazały, że inhibitory mTOR, takie jak rapamycyna, która wcześniej uzyskała zgodę FDA na leczenie raka, skutecznie eliminowały braki w zachowaniach społecznych i powtarzalnych u myszy z mutacją TSC w 7. dniu po urodzeniu i jedynie deficyty społeczne u 6-tygodniowych mutantów TSC myszy [ 118 , 119 ]. Jednakże translacyjne próby hamowania mTOR nie powiodły się w zakresie poprawy funkcjonowania poznawczego, problemów behawioralnych, autyzmu i deficytów neuropsychologicznych u dzieci w wieku 4-17 lat leczonych ewerolimusem – innym inhibitorem mTOR, który został wcześniej zatwierdzony przez FDA do leczenia raka [ 120 ]. Biorąc pod uwagę te wyniki, ważne jest, aby wziąć pod uwagę moment podania leku, ponieważ wcześniejsza interwencja może zapewnić większą skuteczność leczenia, o czym świadczy zależny od wieku sukces w badaniach na myszach.

Ratowanie hamujących szlaków sygnałowych

Wcześniej postawiono hipotezę, że potencjalną utratę równowagi neuronalnych sygnałów pobudzających/hamujących [ 121 , 122 , 123 ] w obrębie podtypów syndromicznych ASD, takich jak FXS, RTT, AS i w idiopatycznym ASD, można przypisać zmniejszeniu hamującego GABA _A funkcja receptora [ 124 , 125 ]. Zatem zwiększenie lub wzmocnienie funkcji receptora GABAA _może być potencjalnym celem terapeutycznym w ratowaniu fenotypów ASD. Niedawno pojawił się arbaklofen, agonista GABA _B , jako potencjalny lek na ASD. W mysim modelu z delecją 16p11.2 stwierdzono, że arbaklofen pomaga w leczeniu deficytów pamięci, mierzonych na podstawie zachowania polegającego na zawieszaniu się w zależnych od kontekstu zadaniach uczenia się awersyjnego [ 126 ]. To samo badanie wykazało, że arbaklofen skutecznie łagodził deficyty w interakcjach społecznych między mężczyznami i kobietami, mierzone na podstawie wąchania od nosa do odbytu i odbytu oraz czasu, jaki mężczyzna spędzał w podążaniu za samicą w okresie rui. W małym badaniu klinicznym z udziałem 25 nastolatków stwierdzono, że arbaklofen ratuje powolne przetwarzanie sensoryczne słuchowe u mężczyzn z idiopatycznym ASD [ 127 ]. Należy jednak wziąć pod uwagę, że chociaż idiopatyczne badanie ASD odniosło pewien sukces, badania kliniczne III fazy z udziałem dzieci (w wieku 5–11 lat) i młodzieży do dorosłych (w wieku 12–50 lat) pacjentów z FXS zakończyły się niepowodzeniem, ponieważ nie byli w stanie osiągnąć podstawowego rezultatu, jakim było ratowanie deficytów społecznych [ 128 ]. Wyniki tego badania klinicznego fazy III sugerują, że przyszłe badania powinny uwzględniać wyższe dawki, większą liczebność próby, młodszą grupę wiekową i lepsze mierniki wyników. Dlatego też, chociaż stymulacja receptora GABAB _przy użyciu arbaklofenu w celu zwiększenia hamujących sygnałów neuronalnych i ratowania nieprawidłowej równowagi pobudzenia/hamowania w ASD może okazać się obiecująca, heterogeniczność genetyczna ASD może utrudniać jego dalsze stosowanie. W przyszłych badaniach klinicznych dotyczących ASD wyraźnie potrzebna jest stratyfikacja genetyczna pacjentów i lepsze pomiary wyników klinicznych.

Ratowanie pobudzających szlaków sygnałowych

Alternatywna hipoteza głosi, że wzrost pobudzającej sygnalizacji glutaminianu może odgrywać rolę w rozregulowaniu równowagi neuronalnych sygnałów pobudzających/hamujących. W FXS stwierdzono, że nastąpił przyczynowy wzrost metabotropowego receptora glutaminianu 5 (mGluR5), który towarzyszy utracie ekspresji FMR1 [ 129 ]. Hamowanie molekularne w loci mGluR5 było skuteczne w wielu modelach mysich. U myszy BTBR zastosowanie antagonisty mGluR5, MPEP, skutecznie uratowało fenotyp powtarzalnej pielęgnacji [ 130 ]. MPEP uratował także nie tylko tę samą powtarzalną pielęgnację, ale także związane z lękiem zakopywanie marmurów i poruszanie się w mysim modelu kwasu walproinowego (VPA) [ 131 ]. Co więcej, leczenie z użyciem negatywnego modulatora allosterycznego (NAM) mGluR5 CTEP uratowało upośledzoną pamięć w mysim modelu mikrodelecji 16p11.2 [ 132 ]. Tłumaczenie kliniczne okazało się jednak wyzwaniem, a badania przedkliniczne nad NAM mGluR5 nie pozwoliły na uratowanie fenotypów u ludzkich pacjentów z FXS [ 133 ]. Niepowodzenia w badaniach przedklinicznych można prawdopodobnie przypisać niewłaściwej ekstrapolacji dawek z modeli mysich, zbyt krótkiemu czasowi leczenia lub temu, że hamowanie mGluR5 jest preferencyjnie skuteczne w młodszej populacji – parametry te można dostosować w przyszłych badaniach [ 134,135 ] Wczesne, ciągłe hamowanie sygnalizacji mGlu grupy 1 częściowo uratowało nieprawidłowości kręgosłupa dendrytycznego w mysim modelu zespołu łamliwego chromosomu X z nokautem Fmr1 [ 133 ].

Inna niedawno odkryta strategia terapeutyczna w leczeniu ASD polega na celowaniu w małą GTPazę, RhoA, która bierze udział w strukturze i ruchliwości cytoszkieletu komórkowego [ 136 ] i stwierdzono, że jej poziom jest podwyższony w niektórych modelach ASD, podczas gdy w innych jest obniżony [ 34,137,138 , 139 ]. Cullin3 ( Cul3 ) jest genem istotnym dla całego genomu ryzyka ASD [ 26 ], którego haploinsuficiency przyczynia się do zmniejszonego wzrostu dendrytów neuronalnych i zmniejszonej aktywności sieci neuronowej [ 34 ]. Ponieważ mysi model z haploinsufitem Cul3 również wykazał zwiększoną ekspresję RhoA, zastosowano leczenie z użyciem inhibitora RhoA Rhosin, aby skutecznie uratować te fenotypy in vitro w hodowlach pierwotnych neuronów korowych pochodzących od tych myszy [ 34 ]. W mysim modelu stresu afektywnego, opartym na porażce społecznej, stwierdzono również, że Rhosin ratuje fenotypy behawioralne, takie jak upośledzone nowe interakcje myszy i zachowania unikające poprzez supresję receptora dopaminy 1 średnich neuronów kolczastych (D1-MSN) w jądrze półleżącym ( NAc) [ 140 ]. Podobnie u myszy Kctd13 (gen w 16p11.2 CNV) z haploinsuficientem i nokautem nastąpił wzrost ekspresji RhoA w połączeniu z niedoborami sygnalizacji synaptycznej – efekt, który został złagodzony po leczeniu Rhosin [ 137 ]. Te sukcesy w modelach mysich dostarczają dowodów, że Rhosin może być ważną metodą terapeutyczną dla osób z delecją w loci 16p11.2 lub Cul3 .

Wirusowe dostarczanie konstruktów genowych CRISPR-Cas9 i ASO jest powszechnie stosowaną metodą wykorzystującą wektory, takie jak lentiwirusy, adenowirusy i wirusy związane z adenowirusami (AAV) [ 141 ] (Tabela 1 ). Chociaż są one powszechnie stosowane, ważne jest, aby wziąć pod uwagę potencjalne wady, takie jak odpowiedź immunologiczna danej osoby na te wektory, a także ograniczenia dotyczące wielkości opakowań. Chociaż wektor adenowirusowy może mieć większy limit upakowania do ~36 kb, istnieje większe ryzyko zapalnej odpowiedzi immunologicznej [ 142 ]. Z drugiej strony AAV mają ograniczony rozmiar opakowania wynoszący ~5 kb i charakteryzują się znacznie łagodniejszym ryzykiem zapalenia [ 143 ]. Innym ważnym wektorem wirusowym jest lentiwirus, który jest rodzajem retrowirusa o rozmiarze opakowania wynoszącym ~9 kb – co stanowi wartość pośrednią pomiędzy wektorami adenowirusa i AAV [ 144 ]. Jedną z głównych zalet lentiwirusa jest jego zdolność do dostarczania transgenów i integrowania ich z genomem w celu długotrwałej ekspresji. Jednakże ta zaleta zwiększa ryzyko wystąpienia efektów ubocznych w wyniku mutagenezy insercyjnej, ponieważ lentiwirusy nie mają wysokiej specyficzności. Mutageneza insercyjna jest wynikiem integracji egzogennego DNA lentiwirusa z genomem gospodarza w otwartych regionach, a jeśli nastąpi to w miejscu innym niż docelowy, może skutkować nieprawidłową ekspresją genów [ 145 ]. Badania wykazały również, że wektor lentiwirusowy stwarza umiarkowane ryzyko zapalenia, ale potrzebne są dalsze badania nad immunogennością i zapobieganiem zdarzeniom rekombinacyjnym w celu optymalizacji translacji klinicznej [ 146 ].

Pomimo wcześniejszych przekonań, że AAV nie podlegają mutagenezie insercyjnej, niektóre badania sugerują, że AAV mają tendencję do przypadkowej integracji z genomem podczas pęknięć podwójnej nici (DSB) [ 147 ], co prowadzi do powstawania nowotworów i rozrostu komórek wątroby u zwierząt [ 148 ]. Na przykład w mysim modelu mukopolisacharydozy (MPS VII) dostarczenie noworodkom myszy transgenu b-glukuronidazy przy użyciu wektora AAV2 spowodowało, że u myszy rozwinął się rak wątrobowokomórkowy (HCC) – z dowodem integracji AAV z guzami [ 149,150 ] Większość integracji AAV wystąpiła w RNA odciśniętym i zgromadzonym w jądrze ( locus Rian) , co przyczynia się do przejścia nabłonka do mezenchymalnego w przypadku raka [ 148 ]. Badania te sugerują również, że wiek odgrywa rolę w rozwoju HCC indukowanym przez AAV, ponieważ Rian wyraża się w większej ilości na początku życia. W modelu psa chorego na hemofilię stwierdzono integrację AAV cztery lata po leczeniu psim czynnikiem VIII (cFVIII) w wektorze AAV8/9, jednakże nie było dowodów na powstawanie nowotworu u tych psów, które miały integrację AAV . .

Integracyjna skłonność AAV jest szczególnie ważna do rozważenia w świetle terapii polegających na edycji genomu. Ponieważ stwierdzono, że AAV integrują się z DSB z dużą częstotliwością [ 152 ] , przed translacją kliniczną należy dokładnie ocenić połączenie CRISPR-Cas9 z AAV jako wektorem dostarczającym [ 58,153 ]. Chociaż dotychczas nie zgłoszono żadnych potwierdzonych zdarzeń genotoksycznych u ludzi w wyniku stosowania wektorów rAAV, biorąc pod uwagę powyższe dowody, konieczne będzie przeprowadzenie dalszych badań na większych organizmach modelowych (takich jak NHP) w dłuższych punktach czasowych. Oprócz tego konieczne będzie ciągłe monitorowanie i testowanie biomarkerów HCC w warunkach klinicznych.

Wiele wektorów wirusowych nie przenika przez BBB z dużą skutecznością i należy je wprowadzić poprzez inwazyjne bezpośrednie wstrzyknięcie lub potencjalnie neurotoksyczne rozerwanie BBB [ 154 ]. Ponieważ większość genów ryzyka NDD ulega ekspresji w mózgu, suboptymalne metody dostarczania tych wektorów wirusowych mogą wydawać się nieodpowiednie do klinicznego dostarczania leków NDD. Chociaż niektóre serotypy AAV, takie jak AAV1, AAV2, AAV5 i AAV8, mogą transdukować neurony, nie są one w stanie skutecznie przenikać przez BBB poprzez nieinwazyjne wstrzyknięcie dożylne [ 155 ]. Stwierdzono jednak, że serotyp AAV9 ma zdolność skutecznego przenikania przez BBB po podaniu dożylnym noworodkom i dorosłym myszom [ 156 ]. Dlatego też, w przeciwieństwie do adenowirusa, lentiwirusa i innych serotypów AAV, wektor AAV9 jest w stanie skutecznie uniknąć dwóch głównych problemów: konieczności inwazyjnego wstrzyknięcia i naruszenia integralności BBB, chociaż jego skuteczność transdukcji maleje wraz z wiekiem [ 156 ] . W modelu mysim RTT stwierdzono, że wewnątrzczaszkowe dostarczanie transgenu MECP2 za pośrednictwem AAV9 skutecznie zwiększa przeżycie i niektóre fenotypy behawioralne [ 43 ]. W badaniu klinicznym III fazy wektor AAV9 odniósł sukces w dożylnym dostarczaniu transgenu SMA1 , skutecznie przywracając funkcje motoryczne u pacjentów z SMA [ 157 , 158 ]. Konieczne są dalsze badania, aby szczegółowo zbadać różnice w skuteczności transdukcji środków terapeutycznych pomiędzy zastrzykami dożylnymi i doczaszkowymi/dooponowymi w organizmach modelowych.

Chociaż tradycyjnie głównym wektorem używanym do dostarczania konstruktów CRISPR-Cas9 były AAV, stosunkowo mały rozmiar opakowania (~4,5 kb) sprawia, że ​​badacze muszą oddzielnie dostarczać dwa oddzielne wektory zawierające konstrukt CRISPR-Cas9 (~4,2 kb) i gRNA . W szczególności w podejściu CRISPRa aktywatory transkrypcji, które są połączone z enzymem dCas9, zwiększą długość konstruktu, tak że kombinacja sgRNA i aktywatorów transkrypcji dCas9 będzie zbyt duża, aby można ją było załadować na pojedynczy wektor AAV. Jest to mniej pożądane w warunkach klinicznych, ponieważ wymagałoby wytwarzania dwóch AAV, co znacznie zwiększa koszty opracowania leku.

Biorąc pod uwagę, że tradycyjny system CRISPR-Cas9 wywodzi się z bakterii Streptococcus pyogenes (SpCas9), najnowsze techniki miały na celu przezwyciężenie tego ograniczenia wielkości poprzez badanie skuteczności innych mniejszych ortologów Cas9. Jeden z takich przykładów obejmuje wykorzystanie mniejszego ortologa Cas9 ze Staphylococcus aureus (SaCas) ( 3,15 kb), który jest o ~1 kb krótszy niż SpCas9, tak że konstrukt CRISPR-Cas9 i gRNA mogą zmieścić się w pojedynczym wektorze AAV [ 159,160 ] Technika ta skutecznie przywróciła ekspresję sensownego genu UBE3A poprzez degradację NAT w mysim modelu AS, jak również uratowała fenotypy choroby w mysim modelu DMD [ 58,161 ] . Podobnie Cas9 z Campylobacter jejuni (CjCas9) (2,95 kb) zastosowano w wektorach z pojedynczym AAV, aby skutecznie zmniejszyć fenotyp neowaskularyzacji naczyniówkowej w mysim modelu zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem (AMD) [ 162 ]. Dalsze eksperymenty powinny zbadać skuteczność CjCas9 w ratowaniu fenotypów związanych z NDD.

Ponieważ BBB zapobiega również przedostawaniu się do OUN większości leków małocząsteczkowych, oprócz wspomnianych wcześniej wektorów wirusowych, niedawny rozwój wariantów AAV9 okazał się potencjalnym kluczem do rozwiązania tego problemu. Warianty takie jak rAAV-PHP.B i rAAV-PHP.eB drugiej generacji zawierają zmodyfikowany kapsyd, który przyczynia się do niespotykanej dotąd skuteczności przekraczania bariery krew-mózg po wstrzyknięciu dożylnym, wraz z dużą zdolnością dyfuzji zarówno do neuronów, jak i do komórek glejowych myszy [ 163 , 164 , 165 , 166 ]. Wysoka skuteczność krzyżowania przez BBB rAAV-PHP.B i rAAV-PHP.eB wynika z ich interakcji z białkiem LY6A (znanym również jako SCA-1) ulegającym ekspresji na komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMVEC) mysiego BBB [ 167 ]. Niestety, LY6A nie ulega ekspresji u naczelnych, co stanowi główną przeszkodę translacyjną dla przenikania ludzkiego BBB. W świetle tych przeszkód translacyjnych dla rAAV-PHP.eB i rAAV-PHP.B, w jednym z ostatnich badań uzyskano AAV.CPP16 poprzez wstawienie peptydów penetrujących komórki (CCP) do kapsydu AAV9 pomiędzy aminokwasami Q588 i A589 [ 168 ]. W porównaniu z niezmodyfikowanym AAV9, dożylne wstrzyknięcie AAV.CPP16 myszom wykazało znacznie większą skuteczność krzyżowania przez BBB, większą wydajność transdukcji i wyższą specyficzność neuronów w obrębie wielu szczepów myszy i makaków cynomolgus. Chociaż wektor AAV.CPP16 jest obiecujący dla przyszłości terapii ukierunkowanych na OUN, potrzebne są dalsze badania, aby potwierdzić skuteczne ratowanie w modelach chorobowych.

Lipidoidy pochodzące z neuroprzekaźników (NT-lipidoidy) stały się ostatnio nowym obiecującym wektorem dostarczania, zwłaszcza do OUN. Jedno z badań wykazało niedawno, że wektor NT-lipidoidowy z powodzeniem wprowadził ukierunkowany na Tau ASO, lek małocząsteczkowy i białko fuzyjne do mózgu myszy poprzez wstrzyknięcie dożylne [ 169 ]. Podobnie nanocząsteczki można potencjalnie wykorzystać do dostarczania leków do mózgu w ramach dwuetapowej strategii celowania, która wykorzystuje wysoką nieprzepuszczalność BBB do selektywnego zatrzymywania znaczników ligandów na powierzchni śródbłonka mózgu [ 170 ]. Dowody z innych badań wykazały, że ASO, mRNA, konstrukty CRISPR-Cas9 i leki małocząsteczkowe można dostarczać za pomocą wektorów nanocząstek lipidowych [ 171 , 172 , 173 , 174 ]. Dlatego opracowanie lepszych wektorów do ukierunkowania specyficznego dla mózgu i neuronów mogłoby w dalszym ciągu udoskonalać strategie terapeutyczne NDD.

W tym przeglądzie zbadano trzy główne cele interwencji w przypadku NDD w oparciu o główny dogmat, w szczególności na poziomach: DNA, mRNA i białka. Chociaż w modelach in vitro i zwierzęcych odniesiono duży sukces na poziomie DNA i białka, nie udało się jeszcze zastosować tych leków w badaniach klinicznych na ludziach. Różne techniki terapeutyczne omówione w tym przeglądzie, które były w trakcie badań klinicznych lub zakończyły się pomyślnie, podsumowano w Tabeli 2 .

Wysiłki mające na celu leczenie haploinsuficiencji genów będą wymagały dokładnego rozważenia specyficzności typu komórki, specyficzności tkanki i modulowania ekspresji prawidłowych izoform splicingowych – coś, co będzie się różnić w zależności od tkanki i etapów rozwojowych [ 175 ]. Alternatywne splicing odgrywa ważną rolę w NDD, a geny ryzyka ASD wykazują różną ekspresję izoform (DEI) na każdym etapie rozwoju prenatalnego [ 176 , 177 , 178 ]. Co więcej, DEI wpływają na ścieżki zaangażowane w rozwój dendrytów, organizację synaps i projekcję neuronalną, czyli procesy, które są rozregulowane w przypadku ASD [ 12 , 177 ]. Jedno z badań wykazało, że w neuronach pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka NRXN1 ^+/- (hiPSC) nastąpił znaczny wzrost ekspresji nowych izoform NRXNα , w połączeniu ze spadkiem izoformy NRXNα typu dzikiego [ 179 ]. To rozregulowanie równowagi izoformy NRXNα spowodowało zmniejszenie aktywności neuronów i zakłócenia w dojrzewaniu neuronów. Dlatego też podczas procesu opracowywania terapii konieczne jest uwzględnienie wieku pacjenta, izoform specyficznych dla typu komórki, alternatywnych miejsc startu i alternatywnych promotorów genów docelowych. Siła promotora w terapii transgenowej lub modulacja aktywatorów transkrypcji CRISPRa będzie odgrywać kluczową rolę w określeniu odpowiedniego leczenia i uniknięciu nieprzewidywalnych lub niepożądanych konsekwencji leczenia.

Biorąc pod uwagę niedawne wysiłki polegające na skupieniu się na ratowaniu terapeutycznym genów w NDD, możliwe, że następna dekada przyniesie sukces translacyjny. Sukces ten zależy od dalszej optymalizacji technik będących jeszcze w powijakach, takich jak CRISPRa lub ASO oparte na uORF/hamujące NMD. Co więcej, mechanizmy terapeutyczne, takie jak ASO alternatywnego splicingu, które mają aprobatę FDA dla patologii innych niż NDD, takich jak Spinraza (SMA) i Eteplirsen (DMD), mogą stanowić solidną podstawę do dalszych badań z wykorzystaniem tych ASO dla genów z mutacjami splicingowymi związanymi z NDD. Jak dowodzą leki hamujące mTOR w leczeniu TSC, moment podania leku jest również ważnym czynnikiem wpływającym na pomyślne zastosowanie kliniczne.

W przypadku NDD niezwykle ważne będzie jak najszybsze zdiagnozowanie choroby, aby móc zastosować leki w krytycznych okresach rozwoju mózgu. Mając to na uwadze, badania wykazały, że okres od połowy płodu do wczesnego okresu poporodowego jest krytycznym oknem dla rozwoju neurologicznego, w którym ulega ekspresji wiele genów ryzyka ASD [ 180 , 181 , 182 ]. Przykład takiego można zaobserwować w badaniu, w którym zależna od Cre aktywacja Ube3a u embrionalnych myszy Ube3a ^Stop/p+ przywróciła wszystkie związane z AS deficyty motoryczne, behawioralne i neurologiczne, podczas gdy reaktywacja Ube3a u myszy po urodzeniu wykazała malejącą skuteczność wraz z wiekiem w zakresie motoryki. koordynacja ratownictwa [ 183 ] . Wraz z rozwojem strategii podawania leków ukierunkowanych na OUN i potencjalnymi powikłaniami związanymi z dostarczaniem leków w okresie prenatalnym, NDD będzie prawdopodobnie najskuteczniejsze w leczeniu we wczesnym okresie poporodowym. Należy zauważyć, że te punkty czasowe nie będą miały uniwersalnego zastosowania do wszystkich genów i wszystkich fenotypów. Inne badania wykazały skuteczne wyleczenie deficytów neurologicznych i elektrofizjologicznych u dorosłych myszy Ube3a Stop ^/p+ po reaktywacji genu Ube3a oraz uratowanie defektów neurologicznych u dorosłych myszy Mecp2 ^lox-Stop/y po reaktywacji genu Mecp2 [ 183,184,185 ] Podobnie, wcześniej omawiane badanie Scn2a CRISPRa skutecznie uratowało deficyty elektrofizjologiczne u dorastających myszy z haploinsufitem Scn2a [ 78 ]. Ta heterogeniczność ratowania fenotypowego w różnych punktach czasowych rozwoju sugeruje, że okresy interwencji terapeutycznej będą musiały być oceniane w oparciu o gen po genie.

Ponieważ modele mysie nie są w stanie dokładnie odzwierciedlić okresów neurorozwoju człowieka, kolejnym krokiem translacyjnym mogłoby być opracowanie modeli haploinsufficiencji w obrębie NHP – czegoś, co zostało już ustalone dla genów SHANK3 i MECP2 u makaków cynomolgus [ 35 , 36 ]. Marmozeta zwyczajna ( Callithrix jacchus ) to kolejny potencjalny organizm modelowy ludzkiej NDD, a badania wykazały, że ekspresja genów i wzorce dystrybucji genów w mózgach ludzi i marmozet były bardziej podobne niż u ludzi i myszy [ 186 ]. Oprócz tego w ramach innego badania udało się z powodzeniem opracować transgeniczny model marmozety choroby Huntingtona (HD) [ 187 ]. Te marmozety wykazywały dystonię i pląsawicę – formy mimowolnych ruchów, które są fizjologicznymi fenotypami HD. Biorąc pod uwagę te wyniki, cenne może być kontynuowanie badań NDD na transgenicznych modelach NHP w ramach badań oceniających skuteczność terapii terapeutycznych w różnych punktach czasowych rozwoju neurorozwojowego.

Kolejną przeszkodą w przełożeniu klinicznym jest optymalizacja metod dostarczania leków. Rozważając zastosowanie wektorów wirusowych w NDD, należy wziąć pod uwagę zrównoważenie specyficzności tkankowej, immunogenności, ograniczeń pakowania i zdolności do penetracji BBB. Wraz z pojawieniem się technologii, takich jak wektory oparte na lipidach, możliwe będzie pokonanie przeszkód związanych z wektorami wirusowymi w opracowywaniu środków terapeutycznych. Ponieważ jednak wektory oparte na lipidach są wciąż w powijakach, potrzebne są dalsze badania, aby wyraźnie porównać zarówno skuteczność, jak i bezpieczeństwo wektorów wirusowych i lipidowych.