-1.6 C
Gdańsk
sobota, 8 lutego, 2025

Genomiczne dowody na dwuetapową transmisję wczesnej siódmej pandemii cholery / Yun Luo, Michael Payne, Sandeep Kaur, Sophie Octavia i Ruiting Lan

0
43
1992 Dr.?? This cholera patient is drinking oral rehydration solution (ORS) in order to counteract his cholera-induced dehydration. The cholera patient should be encouraged to drink the Oral Rehydration Solution (ORS). Even patients who are vomiting can often be treated orally if they take small frequent sips. Their vomiting will subside when their acidosis is corrected.

(Ze źródła) Ten pacjent z cholerą pije doustny roztwór nawadniający (ORS), aby przeciwdziałać odwodnieniu wywołanemu cholerą. Pacjenta z cholerą należy zachęcać do picia doustnego roztworu nawadniającego (ORS). Nawet pacjenci, którzy wymiotują, często mogą być leczeni doustnie, jeśli będą pić małe, częste łyki. Ich wymioty ustąpią, gdy ich kwasica zostanie skorygowana. Domena publiczna.

Streszczenie

Siódma pandemia cholery rozpoczęła się w 1961 roku w Indonezji i rozprzestrzeniła się na cały świat w trzech falach w kolejnych dekadach. W tym artykule wykorzystaliśmy dowody genomiczne, aby szczegółowo opisać pierwszą falę siódmej pandemii. Całkowicie zsekwencjonowano genomy 22 siódmych izolatów Vibrio cholerae z pandemii z lat 1961–1979. Wraz ze 152 publicznie dostępnymi genomami z tego samego okresu, znalazły się one w siedmiu klastrach filogenetycznych (CL1–CL7). Na podstawie wielopoziomowego typowania genomu (MGT) wszystkie zostały przypisane do MGT2 ST1 (Fala 1), z wyjątkiem trzech izolatów w CL7, które zostały oznaczone jako MGT2 ST2 (Fala 2). Siódma pandemia z Fali 1 rozprzestrzeniła się w dwóch etapach, przy czym Etap 1 (CL1–CL5) rozprzestrzenił się w Azji, a Etap 2 (CL6 i CL7) rozprzestrzenił się na Bliski Wschód i Afrykę. Trzy niesynonimiczne mutacje, po jednej w trzech genach regulacyjnych, csrD (globalny regulator) , acfB (chemotaksja) i luxO (wyczuwanie kworum) mogły krytycznie przyczynić się do jego pandemiczności. Trzy izolaty MGT2 ST2 w CL7 były prekursorami Fali 2 i ewoluowały z Fali 1 wraz z nabyciem nowego plazmidu IncA/C. Nasze odkrycia dostarczają nowych spostrzeżeń na temat ewolucji i transmisji wczesnej siódmej pandemii, co może pomóc w przyszłej profilaktyce i kontroli cholery.

Podobna treść jest oglądana przez innych

Wstęp

Cholera to ostra i szybko postępująca choroba biegunkowa, powodująca szacunkowo 1,3 do 4,0 milionów zachorowań i 21 000 do 143 000 zgonów na całym świecie każdego roku 1 . Czynnikiem wywołującym cholerę jest bakteria Gram-ujemna o kształcie przecinka, Vibrio cholerae 2 . W V. cholerae występuje ponad 200 serogrup , ale odnotowano, że tylko serogrupy O1 i O139 powodują chorobę o charakterze epidemii i pandemii 3 .
V. cholerae wywołała siedem pandemii cholery od czasu, gdy pierwsza pandemia rozprzestrzeniła się z Indii w 1817 r. 4 , 5 . Obecna, siódma pandemia została wywołana przez V. cholerae serogrupy O1 i biotypu El Tor, pochodzącego z Sulawesi w Indonezji w 1961 r . 6 . Zmiana biotypu z klasycznego na El Tor zbiegła się z pierwszą falą transmisji na dużą skalę w latach 1961–1966 i rozprzestrzeniła się na większość Azji. Biotyp El Tor dominował wówczas w Indiach, ale biotyp klasyczny nadal dominował w Bangladeszu w tym okresie. W 1971 r. nastąpił drugi gwałtowny wzrost zachorowań na cholerę, który rozprzestrzenił się z Azji do Afryki i Europy 7 . W latach 80. nastąpił okres zastoju cholery, podczas którego cholera była ograniczona do Azji i Afryki, a następnie w kolejnych dekadach nastąpiły wzrosty i powtarzające się rozprzestrzenianie na kontynenty aż do dziś 2 .
Wiele badań genomicznych zbadało pochodzenie i ewolucję siódmej pandemii8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Siódmy klon pandemii powstał ze swojego prekursora w Makasar (Sulawesi) w Indonezji w 1960 roku, głównie poprzez zmiany mutacyjne, aby uzyskać zdolność rozprzestrzeniania się pandemii8 i rozprzestrzenić się na inne kraje w 1961 roku, co oznaczało początek pandemii7 . Nastąpiło szerokie globalne rozprzestrzenianie się, a także utworzono endemiczną niszę środowiskową w Bangladeszu i Indiach17 , 18 , 19 , 20. Rozprzestrzenianie się pandemii można podzielić na trzy fale9 . Fala 1 (1961–1999) rozprzestrzeniła się globalnie ze swojego miejsca pochodzenia, Indonezji, do Zatoki Bengalskiej w Indiach i dalej do Afryki Wschodniej i Ameryki Południowo-Zachodniej. Fala 2 (1978–1984) rozprzestrzeniła się z subkontynentu indyjskiego na Azję Wschodnią i Afrykę 9 , 10 , 21. Fala 3 (od 1991 r.) rozprzestrzeniła się ponownie na Afrykę i Amerykę Południową 9 , 10 , 14 , 21 , 22 .
Transmisja siódmej pandemii od lat 70. XX wieku w Europie, Afryce i obu Amerykach została dobrze zbadana za pomocą analizy genomicznej 10 , 11 , 12 , 13 , 14 . Jednak transmisja siódmej pandemii w jej wcześniejszych latach od 1961 do 1979 roku (przed wejściem w okres niskiej zachorowalności na cholerę w latach 80. XX wieku) pozostała mniej dobrze zbadana z powodu braku danych genomicznych. W tym badaniu wygenerowaliśmy 22 kompletne genomy V. cholerae z izolatów pobranych w latach 1961–1979 i wykorzystaliśmy analizę filogenetyczną do porównania ich ze 152 publicznie dostępnymi genomami szczepów zebranych przed 1980 rokiem, aby dostarczyć dowodów o wysokiej rozdzielczości na globalne transmisje we wczesnych stadiach obecnej siódmej pandemii i uzyskać jaśniejsze zrozumienie ewolucji pandemii cholery.

Wyniki

Kompletne sekwencje genomu 22  izolatów V. cholerae i porównanie pojedynczych polimorfizmów nukleotydowych (SNP)

Łącznie 22 izolaty z lat 1961–1979 zostały całkowicie zsekwencjonowane przy użyciu kombinacji sekwencjonowania Oxford nanopore i Illumina (Tabela  1 ). Izolaty zsekwencjonowane w tym badaniu były rozproszone w 16 krajach, ale ograniczone do trzech kontynentów: Azji (15), Afryki (6) i Europy (1). Spośród 22 nowo zsekwencjonowanych izolatów cztery pochodziły z Bangladeszu, trzy z Indii, dwa z Wietnamu, a pozostałe 13 z 13 różnych krajów. Sześć publicznie dostępnych kompletnych genomów z Azji, w tym pięć wczesnych izolatów siódmej pandemii (1961–1978) i jeden szczep sprzed siódmej pandemii (C5) z 1957 roku, zostało pobranych z GenBank i uwzględnionych w tym badaniu. C5 był najbliższym izolatem sprzed siódmej pandemii 8 i został użyty jako grupa zewnętrzna i do porównania w celu zidentyfikowania zmian specyficznych dla siódmej pandemii. Izolaty były rozproszone w ciągu 14 nieciągłych lat. Wszystkie izolaty zidentyfikowano jako typ sekwencji (ST) ST69 i grupę serologiczną O1.
Tabela 1 Kompletne genomy V. cholerae O1 użyte w tym badaniu
Porównanie 28 izolatów zidentyfikowało 491 SNP, z których 377 SNP znajdowało się na chromosomie 1, a 114 SNP na chromosomie 2 (Dane uzupełniające  1 ), a 432 i 59 SNP znajdowało się odpowiednio na genach i obszarach międzygenowych. Te geny przenoszące SNP można zaklasyfikować do co najmniej jednej kategorii funkcjonalnej i przydzielono je do 23 kategorii funkcjonalnych. Kategoria mechanizmów przekazywania sygnału była największa i obejmowała 42 geny, po niej nastąpiła kategoria transportu i metabolizmu aminokwasów, która obejmowała 34 geny (Rys. uzupełniający S 1 , Dane uzupełniające  2 ). Większość genów (207) miała pojedyncze SNP, podczas gdy 26 genów miało dwa lub więcej SNP, spośród których 17 genów miało po dwa SNP, cztery geny miały po trzy SNP, dwa geny miały osiem SNP, a jeden gen miał odpowiednio pięć i 12 SNP (Dane uzupełniające  2 ). Co godne uwagi, większość SNP (372/491) to niesynonimiczne SNP (Dane uzupełniające  1 ). Według kategorii funkcjonalnych, 8 kategorii zawierało geny niosące głównie (>80%) niesynonimiczne SNP (Rys. uzupełniający S 1 ).

Analiza filogenetyczna kompletnych genomów i dystrybucja filogenetyczna SNP

Wszystkie zidentyfikowane SNP zostały wykorzystane do analizy filogenetycznej. Szczep C5 sprzed pandemii wyizolowany w 1957 r. został wykorzystany jako grupa zewnętrzna (ryc.  1 ) i jest znany jako najbliższy siódmemu klonowi pandemicznemu 8 . Aby ocenić poparcie dla drzewa, SNP zostały zmapowane na drzewie, przy czym 473 SNP zostały jednoznacznie zmapowane na jednej z 54 gałęzi drzewa (rys. uzupełniający S 2 ), a 18 SNP zostało zmapowanych na wielu gałęziach, które zostały wykluczone.
Ryc. 1: Drzewo filogenetyczne o maksymalnym prawdopodobieństwie kompletnych genomów wczesnej siódmej pandemii (1961–1979).
Rysunek 1
Drzewo zostało ukorzenione przy użyciu szczepu V. cholerae C5 jako grupy zewnętrznej. Metadane są odnotowane po prawej stronie drzewa. Struktury rearanżacji genomu chromosomu 1 są oznaczone jako GS1-GS4 (szczegóły w Supplementary Fig S 5 ). Wypełnione i puste kwadraty oznaczają obecność i brak czynników wirulencji lub genów pokazanych odpowiednio: toksyny cholery (CTXφ), wyspy patogeniczności Vibrio (VPI), siódmych wysp pandemii Vibrio (VSP-I i VSP-II), układu wydzielniczego typu VI (T6SS) i toksyny powtórzeń w toksynie (MARTX) (RTX). Wypełnione kółka oznaczają obecność genu oporności na antybiotyki, jak wymieniono. catB9 jest oznaczony na szaro, ponieważ nie został powiązany z opornością fenotypową. Czerwone gwiazdki oznaczają dwa nowe plazmidy IncA/C. Kolory gałęzi odpowiadają klastrom zidentyfikowanym na Fig.  2 ( szczegóły w Fig.  2 ). Pozostałe kolory w różnych kolumnach służą celom wizualnego oddzielenia.
Obraz w pełnym rozmiarze
Mapowanie SNP na gałęzie pozwoliło nam zbadać dystrybucję wielu SNP z tego samego genu lub regionu międzygenowego wzdłuż drzewa filogenetycznego (Fig. uzupełniający S 2 ). Współwystępowanie wielu SNP z tego samego genu/regionu międzygenowego na tej samej gałęzi może wskazywać na rekombinację, podczas gdy pojedyncze pojawienie się SNP z tego samego genu/regionu międzygenowego na różnych gałęziach sugeruje niezależne zdarzenia mutacyjne. W przypadku 41 genów z więcej niż jednym SNP, te SNP były rozmieszczone na 37 gałęziach drzewa, z których 12 było gałęziami wewnętrznymi, a 25 gałęziami końcowymi prowadzącymi do pojedynczego genomu. Większość SNP z tego samego genu była rozmieszczona na różnych gałęziach (Dane uzupełniające  3 ). Jednak sześć genów miało dwa lub więcej SNP zlokalizowanych na tej samej gałęzi. Były zlokalizowane na siedmiu gałęziach, z których sześć było gałęziami końcowymi. luxO miał dwa SNP, każdy zlokalizowany na gałęziach 28 i 34, z odległością między SNP wynoszącą odpowiednio 635 pb i 1047 pb. acp miał dwa SNP oddalone od siebie o 423 pb na gałęzi 36. Różne kopie genu hcpA na chromosomie 1 i chromosomie 2 miały odpowiednio trzy i pięć SNP na gałęzi 51, z odległościami między SNP wynoszącymi od 9 pb do 75 pb. Gen kodujący hipotetyczne białko (VC_A0432) miał trzy SNP, oddalone od siebie o 65 pb i 103 pb, na gałęzi 17 (gałęzi wewnętrznej). Jeden region międzygenowy miał 11 SNP na gałęzi 23, z odległością między SNP wynoszącą od 2 pb do 96 pb (średnio 39 pb).
Porównaliśmy również siódme izolaty pandemiczne z szczepem prekursorowym C5 pod kątem wszelkich unikalnych SNP dla wczesnej pandemii. Dwanaście mutacji zostało wcześniej zidentyfikowanych jako specyficzne dla siódmej pandemii 8 . Te unikalne SNP zostały potwierdzone w tym badaniu. Ponadto zidentyfikowaliśmy trzy niesynonimiczne mutacje, po jednej każdej, w genach csrD, acfB i luxO , które były specyficzne dla wczesnych siódmych izolatów pandemicznych kompletnych genomów (Dane uzupełniające  4 ). Te SNP nie zostały zidentyfikowane jako specyficzne dla siódmej pandemii przez Hu i in. 8 . Przebadaliśmy 7574 siódmych izolatów pandemicznych ze wszystkich trzech fal pod kątem tych SNP. SNP na csrD odwrócił się z powrotem do allelu na szczepie C5 w trzech siódmych izolatach pandemicznych (ERR576981 (fala 1), ERR4175611 (fala 2), ERR9716121 (fala 3)) i w ten sposób był specyficzny dla siódmej pandemii. SNP na acfB i luxO okazały się obecne we wszystkich badanych siódmych izolatach pandemicznych. W ten sposób możemy stwierdzić, że trzy zaobserwowane SNP były unikalne dla siódmej pandemii z wyjątkami opisanymi powyżej.

Analiza filogenetyczna wszystkich genomów z wczesnego okresu siódmej pandemii

Nowo zsekwencjonowane kompletne genomy porównano z 152 sekwencjonowanymi genomami Illumina z wczesnego siódmego okresu pandemii (1961–1979) za pomocą analizy filogenetycznej (Rys.  2 , Ryc. uzupełniający S 3 ). Aby lepiej opisać kluczowe wydarzenia czasoprzestrzenne i ewolucyjne, oznaczyliśmy siedem kladów jako klastry (CL1–CL7). Każdy z klastrów zawierał co najmniej jeden kompletny genom. Klastry były dobrze wspierane przez wartości bootstrap, przy czym wszystkie były >74%. Należy zauważyć, że wzdłuż drzewa filogenetycznego i w obrębie klastrów było wiele izolatów wykazujących filogenezę gwiaździstą. Takie rozgałęzione wzorce są typowe dla szybkiej ekspansji populacji organizmu pandemicznego.
Ryc. 2: Drzewo filogenetyczne o maksymalnym prawdopodobieństwie dla wczesnej siódmej pandemii (1961–1979).
Rysunek 2
Drzewo skonstruowano przy użyciu 29 kompletnych genomów i 152 sekwencjonowanych genomów Illumina z siódmych izolatów pandemicznych pomiędzy 1961 a 1979 rokiem i ukorzenionych przy użyciu szczepu C5 jako grupy zewnętrznej. Etap 1 i etap 2 oznaczono jasno- i ciemnoszarym cieniowaniem. Klaster 1 (CL1) do klastra 7 (CL7) oznaczono gałęziami w różnych kolorach i oznaczono przy każdym węźle. Gałęzie przerywane skrócono dla przejrzystości. Rok izolacji pokazano za pomocą mapy cieplnej z kolorami czerwonymi dla lat 60. i niebieskimi dla lat 70. Kontynent/subkontynent pochodzenia każdego izolatu jest wyświetlany za pomocą paska kolorów, a kraj pochodzenia jest wyświetlany, gdy kraj ten został wymieniony w tekście. Wszystkie pozostałe kraje oznaczono kolorem szarym ze szczegółami kraju w Rysunku uzupełniającym S 3. Dla przejrzystości podano nazwy tylko kompletnych genomów. Zobacz Rys. uzupełniający S 3, aby uzyskać pełne szczegóły nazw izolatów i kompletne metadane .
Obraz w pełnym rozmiarze
Na podstawie klasteryzacji filogenetycznej i metadanych, dwa klastry (CL1, CL2) zawierały co najmniej jeden izolat z Indonezji w 1961 r. Ponadto dwa izolaty (SRR6027720 i ERR579063) z Indonezji wyizolowane w 1961 r. były dobrze oddzielone od siebie i od dwóch klastrów. Te dwa klastry i dwa pojedyncze izolaty wyraźnie rozeszły się w Indonezji, zanim rozprzestrzeniły się do innych krajów azjatyckich. Dlatego też przypisaliśmy to początkowe rozprzestrzenienie się jako Etap 1 siódmego rozprzestrzeniania się pandemii, które pochodziło z Indonezji. W Etapie 1 były trzy inne klastry (CL3–CL5). Najwcześniejsze izolaty w CL3–CL5 pochodziły odpowiednio z Kambodży (1963), Japonii (1962) i Indii (1962). Chociaż klastry te nie zawierały żadnych indonezyjskich izolatów, były wyraźnie wcześnie rozprzestrzenione z Indonezji bezpośrednio lub pośrednio.
Większość pozostałych izolatów na drzewie została zgrupowana jako pojedynczy klad, który obejmuje izolaty z Iranu z 1965 r., a także CL6 i CL7, które zawierają izolaty z Bliskiego Wschodu i Afryki. To rozprzestrzenianie się siódmej pandemii przypisaliśmy etapowi 2. Węzeł etapu 2 był wspierany przez dwa SNP z dwóch genów (VC1482 i VC2487, dane uzupełniające  1 ). Tak więc wczesne rozprzestrzenianie się siódmej pandemii z Indonezji jest podzielone na dwa etapy.
Siódmą pandemię podzielono na fale 9 , a trzy fale można rozróżnić, stosując wielopoziomowe typowanie genomu (MGT) 23 . Za pomocą typowania MGT 173 izolaty/genomy zidentyfikowano jako MGT2 ST1, które należą do Fali 1. Trzy izolaty/genomy, M646 i M714 oraz jeden sekwencjonowany genom Illumina (ERR025383) zostały oznaczone jako MGT2 ST2, który należy do Fali 2, co sugeruje, że Fala 2 pochodziła z prekursora w C7.2. Dalsza analiza filogenetyczna tych trzech izolatów z innymi izolatami Fali 2 wykazała, że ​​te trzy izolaty rozeszły się najwcześniej (Rysunek uzupełniający S 4 ). Trzy kolejne sekwencjonowane genomy Illumina zostały oznaczone jako MGT2 ST16, MGT2 ST19 i MGT2 ST829, rozmieszczone pomiędzy izolatami MGT2 ST1 na poziomie filogenetycznym i jednoznacznie należały do ​​Fali 1.

Elementy wirulencji w kompletnych genomach

Zidentyfikowaliśmy geny na każdym znanym elemencie wirulencji, w tym faga toksyny cholery (CTXφ), wyspę patogeniczności Vibrio (VPI), siódme wyspy pandemii Vibrio (VSP-I i VSP-II), system wydzielniczy typu III (T3SS) i system wydzielniczy typu VI (T6SS). Wszystkie geny ctxB zostały przypisane do genotypu ctxB 3. Wszystkie geny tcpA kompletnych genomów z tego badania i szczepu C5 były identyczne. Wszystkie kompletne genomy zawierały 11 genów VSP-I, klaster genów T6SS złożony z 19 genów i cztery geny klastra genów toksyny wielofunkcyjnej-automatycznie-przetwarzającej-powtórzenia-w-toksynie (MARTX) ( rtxA, rtxB, rtxC i rtxD ) (Ryc.  1 ). Prawie wszystkie izolaty zawierały VSP-II, CTXφ i VPI, z następującymi wyjątkami. M647 nie zawierał VSP-II, M815 nie zawierał CTXφ, E9120 nie zawierał VPI, jak wcześniej donoszono24 , a M812 zawierał tylko sześć ( toxT, tcpJ, acfA, acfB, acfC i acfD ) z 19 genów VPI.

Plazmidy i geny oporności w kompletnych genomach

Dwa izolaty (M646 i M714) przenosiły plazmid rodziny IncA/C. Oba izolaty były w CL7.2 i wyizolowano je w Bangladeszu w 1979 r., co było ostatnim rokiem izolacji w tym badaniu (ryc.  1 ). Żaden z pozostałych izolatów z wczesnego okresu pandemii nie przenosił żadnych plazmidów i żaden z izolatów nie przenosił genów lub mutacji oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR).
Plazmid w M646 został nazwany pM646 i został złożony jako koliste DNA o długości 170 552 pb. Zawartość G + C wynosiła 52,59%, co było wartością wyższą niż w genomie gospodarza (47,51%). Przewidziano łącznie 207 sekwencji kodujących (CDS). Stwierdzono, że pM646 przenosi geny AMR aadA2, aph(3”)-Ib, aph(3′)-Ia, aph(6)-Id, bla TEM-1b , dfrA1, qacE, sul1 i tet(A) .
Plazmid w M714 nazwano pM714 i złożono jako koliste DNA o długości 148 732 pb. Zawartość G + C wynosiła 51,58% i przewidziano 180 CDS. pM714 przenosił geny AMR, aadA15, aadA2, ant(2”)-Ia, bla TEM-1b , cmlA1, qacE i sul1 .
Te dwa plazmidy były blisko spokrewnione ze sobą i z plazmidem znalezionym w szczepie Klebsiella pneumoniae wyizolowanym w Australii w 1997 r. (pRMH760,170,613 bp), niosącym geny aadB, sul1, dfrA10, aphA1, bla TEM-1 i catA125 (Ryc.  3 ). W porównaniu do pRMH760 (sekwencja referencyjna NCBI: NC_023898.1) pokrycia pM646 i pM714 wynosiły odpowiednio 95% i 88 %, a identyczności sekwencji nukleotydowych były powyżej 99,9%. Zarówno pM646, jak i pM714 nie miały dwóch fragmentów na pRMH760 zawierających geny catA1 i dfrA10 . Pokrycie i identyczność pM714 do pM646 wynosiły 87% i 99,91%. W przypadku pM714 brakowało dwóch fragmentów na pM646, które przenosiły kilka genów oporności na rtęć ( merA, merB, merD, merE i merP ) oraz gen oporności na aminoglikozydy aph .
Ryc. 3: Porównanie dwóch nowych plazmidów IncA/C z najbardziej spokrewnionym plazmidem pRMH760 Klebsiella pneumoniae.
Rysunek 3

Od wewnętrznego do zewnętrznego okręgu znajdują się trzy plazmidy pRMH760 ( Klebsiella pneumoniae ), pM646 ( V. cholerae M646) i pM714 ( V. cholerae M714). Geny są adnotowane na podstawie pRMH760 (sekwencja referencyjna NCBI: NC_023898.1). Geny oporności na antybiotyki są podświetlone na czerwono, podczas gdy geny oporności na środki antyseptyczne i metale są oznaczone na niebiesko. Wewnętrzne pierścienie to skala rozmiarów, zawartość G + C i przechyły G + C zgodnie z legendą kolorów.

Duplikacje genów w kompletnych genomach

Przeszukaliśmy również całe genomy pod kątem duplikacji genów (Dane uzupełniające  5 ). Osiem genów o znanych funkcjach i sześć genów kodujących hipotetyczne białka zostało zduplikowanych w różny sposób w różnych genomach, w dwóch do trzech kopiach. W porównaniu do szczepu prekursorowego pandemii C5, nie było żadnych genów, które byłyby unikalnie zduplikowane w siódmych izolatach pandemicznych. Żadne zduplikowane geny C5 nie zostały zdeduplikowane do pojedynczej kopii we wczesnych siódmych izolatach pandemicznych. Co ciekawe, jeden gen (locus_tag=VC_A0301) kodujący oksydoreduktazę, który był zduplikowany we wszystkich, z wyjątkiem dwóch, genomach etapu 1, został zdeduplikowany do pojedynczej kopii we wszystkich genomach etapu 2.

Superintegrony (SI) w kompletnych genomach

SI wyekstrahowano z chromosomu 2 z 25 genomów i wyrównano do SI z szczepu C5 grupy zewnętrznej jako odniesienia. Łącznie 32 funkcjonalne geny i do 257 hipotetycznych białek zostało adnotowanych w SI (Dane uzupełniające  6 ). catB9 został zidentyfikowany we wszystkich SI.
W obu liniach SI CL7.1 i CL7.2 stwierdzono jedną dużą delecję (34 872 pb) (ryc.  4 ). Trzy małe delecje stwierdzono w genomach z Indii w CL5. Rozmiar SI i liczba otwartych ramek odczytu (ORF) różniły się w zależności od linii (dane uzupełniające  7 , ryc.  4 ). Największą delecję wynoszącą 54 651 pb zaobserwowano w M820 (w CL5), izolacie z Malezji z 1978 r.
Rys. 4: Dopasowania superintegronów z kompletnych genomów.
Rysunek 4
Superintegrony (prawy panel) zostały wyekstrahowane z chromosomu 2 każdego kompletnego genomu i wyrównane do szczepu C5. Liczba pod znacznikami rozmiaru integronu jest w parach zasad (bp). Puste segmenty linii oznaczają delecje. Czerwone trójkąty na górze segmentów oznaczają duże insercje. Sekwencje genomu chromosomu 2 szczepów oznaczonych na czerwono nie zostały zamknięte, dlatego superintegrony nie zostały przedstawione. Strzałki oznaczają orientację każdej wyrównanej sekwencji. Biała strzałka oznacza brakujące zasady. Kolory roku i kraju służą do wizualnego rozdzielenia. Drzewo było takie samo jak na rys.  1 .
Obraz w pełnym rozmiarze
Znaleziono dwa zdarzenia insercji (Rys.  4 ). Identyczną insercję (Insercja 1) o długości 1376 pb znaleziono w trzech genomach (N16961, P27459 i M795) w pozycji 1192 na SI. Region insercji był duplikacją regionu obecnego w SI każdego genomu. Był identyczny z regionami na chromosomie 1 i chromosomie 2 szczepu O395 kodującymi hipotetyczne białka. Inną insercję (Insercja 2) o długości 1270 pb zidentyfikowano tylko w P27459 w pozycji 44867 na SI. Insercja 2 była sekwencją insercji, IS Vch4 , wstawioną do SI. IS Vch4 jest również obecny na chromosomie 1 z 26 kompletnych genomów kodujących transpozazę OrfA i OrfB (Dane uzupełniające  8 ).

Przegrupowanie genomu w kompletnych genomach

Zidentyfikowano cztery struktury genomiczne (GS) chromosomu 1 z przegrupowaniami dużych fragmentów genomów (GS1-GS4) (Fig. uzupełniający S 5 ). Większość izolatów (22/29) należała do GS2. Cztery należały do ​​GS1 (szczep C5, E9120, CRC711 i N16961), dwa do GS4 (M803 i M813), a jeden do GS3 (M647). Dokonaliśmy również dopasowania chromosomu 2 ze wszystkich izolatów i nie znaleźliśmy żadnych przegrupowań.

Dyskusja

Etapy transmisji cholery na początku siódmej pandemii

Pierwsza z trzech fal siódmej pandemii cholery (Fala 1) miała miejsce w latach 1961–1999 i rozprzestrzeniła się z Indonezji do sąsiednich krajów, a także do Afryki Wschodniej i Ameryki Południowo-Zachodniej7 , 9. Dalsze badania ujawniły liczne zdarzenia transmisyjne w Afryce (T1–T13) 11 , Ameryce Łacińskiej (LAT1–LAT3) 10 i Europie (EUR1–EUR8) 14 . W tym badaniu przeanalizowaliśmy ewolucję wczesnej siódmej pandemii (od 1961 do 1979 r.) przy użyciu kompletnych genomów, a także dużego zestawu roboczych genomów z tego samego okresu. Odkryliśmy, że w tym wczesnym okresie pandemii występowały dwa odrębne etapy transmisji. Etap 1 reprezentował początkowe rozprzestrzenianie się z Indonezji, obejmujące izolaty klastra CL1-CL5 z krajów azjatyckich. Odkryliśmy, że w stadium 1 V. cholerae rozproszyła się już w Indonezji w 1961 r., a te rozproszone szczepy rozprzestrzeniły się równolegle do innych krajów azjatyckich na początku lat 60. w tym samym czasie. Niektóre z klastrów przetrwały do ​​końca lat 70. Ponieważ w tym badaniu uwzględniliśmy tylko izolaty sprzed 1980 r., prawdopodobne było, że te klastry krążyły szeroko w Azji, zanim fala 1 została zastąpiona innymi falami9 .
Nie jest chyba zaskakujące, że siódma pandemia rozeszła się zanim rozprzestrzeniła się poza Indonezję. Wiadomo, że prekursor siódmego klonu pandemii powodował epidemie w latach 1937-1957 na wyspie Sulawesi w Indonezji7 . Następnie w 1960 roku wybuchła epidemia cholery w Makasar (Sulawesi), która rozprzestrzeniła się na inne kraje azjatyckie w 1961 roku, który uznano za rok rozpoczęcia siódmej pandemii26 , 27. Tak więc minęły co najmniej trzy lata od 1957 roku, zanim siódmy klon pandemii rozszedł się w Indonezji, zanim rozprzestrzenił się na inne regiony.
Etap 2 został naznaczony rozprzestrzenianiem się na Bliski Wschód, gdy ostatni etap cholery rozprzestrzenił się w Azji i przekroczył granice Afryki w latach 70. 11 . Na tym etapie siódma pandemia rozprzestrzeniła się z Azji do Afryki jako klastry CL6 i CL7. CL6 odpowiadał wydarzeniu wprowadzenia do Afryki T1 11 , które rozprzestrzeniło się z krajów Bliskiego Wschodu do krajów Afryki Południowej i Północnej w latach 70. Zidentyfikowano dwa podklastry w CL7. Izolaty CL7.1 krążyły na Bliskim Wschodzie i w Afryce Wschodniej w latach 70., co odpowiadało wydarzeniu wprowadzenia do Afryki T3 11 . Izolaty CL7.2 znaleziono głównie w Bangladeszu i innych krajach azjatyckich pod koniec lat 70. Izolat (M647) w Bangladeszu w 1970 r. dzielił ostatniego wspólnego przodka (MRCA) z innymi izolatami w CL7.2. Założyliśmy, że CL7.1 i CL7.2 oddzieliły się od wspólnego przodka w 1970 r., przy czym CL7.1 rozprzestrzenił się do Afryki Wschodniej poprzez Bliski Wschód11 , podczas gdy CL7.2 pozostał w Azji i był głównie badany w Bangladeszu.
CL7.2 może zawierać ważne informacje na temat dalszego rozwoju siódmej pandemii. Chociaż Bangladesz został dotknięty początkowym rozprzestrzenianiem się siódmej pandemii w latach 60. XX wieku, biotyp klasyczny dominował do 1972 roku, kiedy został zastąpiony biotypem El Tor 7. Prawdopodobne było, że CL7.2 był przyczyną tej wymiany i w konsekwencji doprowadził do fali 2.
Trzy izolaty należały do ​​MGT2 ST2 (dwa kompletne genomy z tego badania i jeden publiczny projekt genomu) i w ten sposób należały do ​​siódmej fali pandemii 2 23 . Wszystkie te izolaty uzyskano w Bangladeszu w 1979 r. i każdy z nich zawierał plazmid IncA/C. Poprzednie badania opisują nabycie elementu integracyjnego i koniugacyjnego SXT/R391 (ICE) jako początek przejścia z Fali 1 do Fali 2 9 . Ponieważ te trzy izolaty rozeszły się najwcześniej spośród izolatów Fali 2, były prawdopodobnie najwcześniejszymi prekursorami Fali 2 i ewoluowały z Fali 1 przez nabycie plazmidu IncA/C zawierającego geny AMR, a nie ICE. Późniejsze nabycie SXT/R391 z opornością na wiele leków musiało zapewnić przewagę szczepom SXT/R391 pozytywnym, ułatwiając rozprzestrzenianie się Fali 2 9 .
Co ciekawe, w klastrze CL6, szczep z Niemiec (M819) wyizolowany w 1975 r. dzielił MRCA ze szczepami afrykańskimi. Transmisja z Afryki do krajów europejskich była prawdopodobnie spowodowana częstymi podróżami wojsk portugalskich między Afryką Południową/Zachodnią a Portugalią na początku lat 70. 28 . Istniało jednak wiele innych możliwych dróg transmisji poprzez handel i podróże ludzi między Afryką a Europą. Co więcej, inny izolat CL6 (M815) z Filipin w 1973 r., gdzie w tym roku zgłoszono 2075 przypadków cholery 7 , dzielił MRCA ze szczepem z Senegalu (M813). Odkrycie sugeruje, że linia zachodnioafrykańska mogła być przenoszona tam i z powrotem między krajami Azji Południowej i Afryki.

Mutacje charakterystyczne dla wczesnej siódmej pandemii, które mogły przyczynić się do jej przejścia w pandemię

Poprzednie badanie wykazało, że siódma pandemia zyskała tylko 12 mutacji w porównaniu do swojego prekursora C5, aby uzyskać dużą pojemność rozprzestrzeniania się 8 . Mutacje te potwierdzono jako specyficzne dla siódmej pandemii w tym badaniu z większą liczbą izolatów od początku pandemii. Jednak nie ma wyraźnego wyjaśnienia, w jaki sposób te geny lub ich zmiany SNP przyczyniły się do ich przejścia pandemicznego 8 . W tym badaniu znaleźliśmy trzy dodatkowe niesynonimowe mutacje w genach csrD, acfB i luxO , które zostały nabyte na początku siódmej pandemii. Wszystkie te geny są zaangażowane w regulację genów i sygnalizację komórkową. CsrA jest wiążącym RNA globalnym regulatorem, który reguluje główny regulator genu wirulencji ToxR i regulon wyczuwający kworum 29 . AcfB jest białkiem chemotaksji akceptującym metyl, a LuxO jest białkiem regulatora wyczuwającego kworum 30 , 31 . Potwierdziliśmy, że te mutacje były obecne we wszystkich lub prawie wszystkich izolatach Wave 2 i Wave 3 i w ten sposób utrzymywały się w siódmym klonie pandemicznym. Nasze odkrycia sugerują, że akumulacja niesynonimicznych mutacji w trzech genach, które odgrywają kluczową rolę w adaptacji i wirulencji, mogła umożliwić pandemiczność siódmego klonu pandemicznego w początkowym rozwoju w Indonezji po tym, jak oddzielił się od swojego prekursora.

Niski poziom rekombinacji i podwyższony wskaźnik mutacji genów adaptacyjnych na początku siódmej pandemii

Aby ustalić, czy rekombinacja przyczyniła się do ewolucji wczesnej siódmej pandemii, zbadaliśmy geny z więcej niż jednym SNP. Ponieważ tempo mutacji wynosiło około trzech SNP na genom na rok9 , prawdopodobieństwo wystąpienia dwóch SNP w tym samym genie jest niskie. Ponadto wykorzystaliśmy informacje filogenetyczne, aby ustalić, czy SNP występowały w tym samym czasie, tj. znajdowały się na tej samej gałęzi. Odkryliśmy, że większość SNP z tego samego genu występowała na różnych gałęziach drzewa filogenetycznego, co sugeruje, że te SNP powstały w wyniku mutacji niezależnie. Jednak było 41 przypadków, w których dwa lub więcej SNP z tego samego genu lub regionu międzygenowego znajdowało się na tej samej gałęzi, co wskazuje, że mogły powstać w wyniku rekombinacji. Tak więc sporadyczne zdarzenia rekombinacji prawdopodobnie miały miejsce podczas wczesnej siódmej pandemii. Zgodnie z hipotezą Hu i in. 32 , niska szybkość rekombinacji w przypadku siódmego klonu pandemicznego może wynikać z faktu, że spędza on mniej czasu w środowisku w okresach pandemii i wybuchu epidemii, a także może przyjąć żywotną, ale niekulturową formę z mniejszymi możliwościami rekombinacji, gdy znajduje się w środowisku.
Ponieważ wiele SNP w tym samym genie zostało w większości uzyskanych niezależnie poprzez mutacje, a wiele z tych SNP było niesynonimicznymi SNP, prawdopodobne było, że niektóre z tych zmian miały charakter adaptacyjny. Gen luxO wyróżniał się najbardziej, z 12 SNP, z których wszystkie były niesynonimicznymi, wśród całkowicie zsekwencjonowanych genomów. W porównaniu do szacowanego wskaźnika mutacji dla siódmej pandemii V. cholerae wynoszącego 3,3 SNP na genom na rok9 , luxO wyraźnie miał podwyższone mutacje. LuxO i HapR/LuxR kodowane odpowiednio przez luxO i hapR to dwa krytyczne białka regulacyjne systemu wykrywania kworum (QS), który jest głównym regulatorem ekspresji genów wirulencji poprzez monitorowanie gęstości populacji30 , 33. QS zwiększa tworzenie się biofilmu i ekspresję genów wirulencji w celu kolonizacji jelita podczas zakażenia u człowieka i zmniejsza te procesy przed opuszczeniem gospodarza ludzkiego, aby promować transmisję34 , 35 . Ta wysoka częstotliwość mutacji wskazuje na pozytywną selekcję na QS w celu ułatwienia zwiększonej transmisji podczas wczesnej siódmej pandemii. Podwyższona częstość mutacji w luxO i hapR utrzymywała się przez wszystkie trzy siódme fale pandemii (Rys. uzupełniający S 6 ).
Ponieważ luxO i hapR miały podwyższone wskaźniki mutacji, zbadaliśmy wszystkie 43 geny z mutacjami w kategorii przekazywania sygnału we wczesnych izolatach siódmej pandemii pod kątem podwyższonego wskaźnika mutacji i znaleźliśmy dodatkowe cztery geny ( arcA, dctB, dctR i VC0694 ) ze stale podwyższonym wskaźnikiem mutacji w siódmej pandemii w różnych falach (rys. uzupełniający S 6 ). ArcA jest globalnym regulatorem dwuskładnikowego układu ArcB/A (TCS) i wiadomo, że reguluje ekspresję genów wirulencji i tworzenie biofilmu 36 , 37 . DctB (VC1925 ) i DctR (VC1926) łączą się jako TCS, które wykrywają C4-dikarboksylany 38 , 39 , ale niewiele wiadomo o celach lub funkcjach regulacyjnych. VC0694 koduje niescharakteryzowaną kinazę histydynową TCS, podczas gdy VC0693 koduje jej pokrewny regulator odpowiedzi i odgrywa rolę w kolonizacji jelit u małych myszy 40 i tworzeniu biofilmu 41 . Wydaje się, że mutacje w podgrupie TCS mogły odegrać adaptacyjną rolę w rozwoju siódmej pandemii, która nie została wcześniej rozpoznana.
Warto zauważyć, że poprzednie badanie chińskich izolatów przeprowadzone przez Didelot i in. 42 wykazało, że dziewięć z 17 szczepów mutatorów spośród 260 badanych siódmych izolatów pandemicznych pochodziło z początku lat 60. Mutatory, które niosą mutacje w genach naprawy niezgodności DNA, mają zwiększone wskaźniki mutacji i mogą ułatwiać adaptację 43 . Jednak nasze kompletne genomy nie zawierały żadnych mutacji mutatorów z badanymi genami naprawy niezgodności ( mutS , mutH, mutL i uvrD ).

Ewolucja AMR i plazmidów we wczesnej siódmej pandemii V. cholerae

W tym badaniu znaleziono dwa plazmidy IncA/C, pM646 i pM714. Plazmidy te znajdowały się w dwóch szczepach z Bangladeszu w 1979 r. Zgłoszono plazmid wielolekooporny z izolatów z epidemii w Bangladeszu w tym samym roku44 , izolaty te były oporne na tetracyklinę, ampicylinę, kanamycynę, streptomycynę, gentamycynę i trimetoprim. Zarówno pM646, jak i pM714 zawierały geny nadające oporność na streptomycynę, ampicylinę i sulfametoksazol. Ponadto pM646 zawierał geny oporności na trimetoprim i tetracyklinę, podczas gdy pM714 zawierał geny oporności na gentamycynę i chloramfenikol. Inny niekompletny genom V. cholerae (ERR025383) z Bangladeszu, wyizolowany w 1971 r., również zawierał tę samą plazmid co pM646 z identycznymi genami AMR.
Geny AMR, takie jak aadA, dfrA, qacE i cmlA , często znajdowano na integronach 45 . Jednak w tym badaniu geny te znaleziono na dwóch plazmidach IncA/C. Nabycie tych plazmidów przez siódmy klon pandemiczny jest interesujące. Wiadomo, że w klonie pandemicznym było obecnych bardzo niewiele plazmidów, prawdopodobnie z powodu dwóch systemów obrony plazmidowej kodowanych przez VPI-2 i VSP-II 46 . Może to również wyjaśniać, dlaczego późniejsze siódme szczepy pandemiczne nabyły SXT ICEs przenoszące geny AMR, a nie plazmidy AMR ze względu na ich selektywną przewagę. Niemniej jednak plazmidy IncA/C odgrywają ważną rolę w nabywaniu AMR u V. cholerae 47 .
Oba plazmidy zawierają qacE , gen oporności na środki dezynfekujące, który jest rzadki u V. cholerae 48 . Po raz pierwszy został zgłoszony w klinicznych i wodnych izolatach V. cholerae nie-O1/nie-O139 49 , a później znaleziony w dwóch plazmidach V. cholerae wyizolowanych ze środowiskowego nietoksygennego szczepu O1 50 i klinicznego szczepu O139 51 w Chinach. W naszych poprzednich badaniach izolatów z Chin gen qac E nie był obecny w żadnym z plazmidów IncA/C izolatów V. cholerae O139 16 lub środowiskowych izolatów nie-O1/nie-O139 52 .

Superintegrony cechują się niewielką liczbą zdarzeń genetycznych na wczesnym etapie pandemii

W badaniu tym stwierdzono stosunkowo niewiele zdarzeń insercji i delecji w SI genomów sekwencjonowanych, co kontrastuje z różnorodnością SI w środowiskowym V. cholerae 53 , 54 . Odkryliśmy, że struktura SI różniła się w obrębie klastrów filogenetycznych. Nasze odkrycia sugerują, że SI na początku siódmej pandemii była dość stabilna, z okazjonalnymi stratami, ale bez zysku nowych kaset. Z kolei badania wykazały, że SI jest dynamiczna i bierze udział w nabywaniu kaset genowych od innych gatunków w celu adaptacji do lokalnych środowisk 55 . Adaptacja środowiskowa mogła nie odgrywać dużej presji selekcyjnej w siódmym klonie pandemicznym, ponieważ była ona głównie przenoszona z człowieka na człowieka w dużych epidemiach z krótkim czasem w lokalnym środowisku we wczesnych latach rozprzestrzeniania się.

Wpływ rearanżacji genomu na wczesną siódmą pandemię

Przegrupowania genomu mogą wpływać zarówno na ekspresję genów, jak i tempo wzrostu 56 , a w konsekwencji mogą mieć wpływ na wirulencję i zdolność przenoszenia. Zidentyfikowaliśmy cztery GS chromosomu 1 we wczesnej siódmej pandemii V. cholerae . GS1 była starszą strukturą znalezioną w szczepie C5 sprzed siódmej pandemii i szczepie E9120 z pierwszej siódmej pandemii. Jednak GS2 była dominującą strukturą w 76% kompletnych sekwencji chromosomu 1 w tym badaniu. Sporadyczne inwersje w GS3, GS4 i powrót do GS1 zidentyfikowano w izolatach zarówno w stadium 1, jak i stadium 2. Chromosom 2 był stabilny bez przegrupowania genomu, z wyjątkiem zmian w obrębie SI. Potrzebne są bardziej kompletne genomy i dalsze badania fenotypowe, aby określić wpływ przegrupowania genomu, w szczególności GS2 w porównaniu z GS1, na ekspresję genów i sprawność.
Podsumowując, analiza kompletnych genomów izolatów od początku siódmej pandemii do końca lat 70., uzupełniona o robocze genomy, pozwoliła nam rozłożyć na czynniki pierwsze pierwszą falę siódmej pandemii. Wczesna siódma pandemia rozprzestrzeniła się w dwóch etapach. W etapie 1 siódmy klon pandemiczny rozproszył się na co najmniej dwa klastry i dwa singletony w Indonezji i rozprzestrzenił się równolegle do innych krajów azjatyckich. W etapie 2 siódma pandemia rozprzestrzeniła się na Bliski Wschód i dalej rozprzestrzeniła się na kraje afrykańskie. Siódma pandemia z fali 1 przekształciła się w falę 2, którą zaznaczyło początkowe nabycie plazmidu IncA/C przenoszącego wiele genów AMR. Trzy niesynonimiczne mutacje w genach regulacyjnych, csrD, acfB, luxO , odpowiednio zaangażowane w globalną regulację genów, chemotaksję i wykrywanie kworum, zostały unikalnie nabyte przez wczesną siódmą pandemię w porównaniu do szczepu C5 sprzed siódmej pandemii i mogły mieć krytyczny wpływ na jej pandemiczność. Ponadto, adaptacyjne mutacje w wielu genach regulacyjnych TCS, zwłaszcza luxO i hapR , były podwyższone, przyczyniając się do rozbieżności i adaptacji siódmej pandemii. Badanie to oferuje analizę o wysokiej rozdzielczości i lepsze zrozumienie obecnej pandemii cholery na wczesnych etapach rozprzestrzeniania się i może pomóc w opracowaniu strategii zapobiegania i kontroli cholery.

Metody

Genomy

Łącznie w tym badaniu zsekwencjonowano 22 izolaty  V. cholerae (Tabela 1 ). Izolaty te zostały zebrane przez inne laboratoria z różnych krajów, przy czym laboratoria źródłowe wymieniono w Tabeli  1. Te szczepy zostały wykorzystane w naszych poprzednich badaniach15 i były historycznie zarchiwizowanymi szczepami. Należy zauważyć, że jeden izolat (M806) był tym samym szczepem, co CRC1106 zsekwencjonowany przez Hu i in. przy użyciu PacBio8 . Porównanie dwóch sekwencji genomowych wykazało 70 różnic w zasadach i trzy różnice w strukturze genomowej (Dane uzupełniające9  ) . Dlatego też użyliśmy naszej sekwencji do przedstawienia szczepu w celu zapewnienia spójności. Siedem publicznie dostępnych kompletnych genomów V. cholerae z siódmej pandemii uzyskano z NCBI (26/05/2022) i uwzględniono w celu porównania. Szczep V. cholerae N16961 (numer dostępowy NCBI: GCF_900205735.1) został użyty jako genom referencyjny, a szczep sprzed siódmej pandemii C5 (GCF_001887395) został użyty jako grupa zewnętrzna do analizy filogenetycznej (Tabela  1 ). Wszystkie genomy zostały zidentyfikowane jako V. cholerae O1 serogrupa ST69 przez nukleotyd BLAST (wersja 2.9.0+) i in silico MLST ( https://github.com/tseemann/mlst ) przy użyciu ustawień domyślnych. Ponadto surowe dane sekwencyjne 152 V. cholerae wyizolowanych między 1961 a 1979 rokiem z krajów afrykańskich i azjatyckich o jakości sekwencji genomu, która przeszła filtry typowania MGT, zostały pobrane z NCBI w celu porównania (Dane uzupełniające  10 ).

WGS z technologią nanoporów

DNA 22 izolatów zostało wyekstrahowane metodą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej i zsekwencjonowane przy użyciu technologii nanopore i platformy Illumina. Do złożenia genomów użyto Canu (wersja 2.2) 57 i Unicycler (wersja 0.4.7) 58. Wszystkie sekwencje genomów w tym badaniu zostały przesłane jako surowe odczyty pod numerem akcesyjnym BioProject PRJNA970070 w bazie danych NCBI SRA.

Analiza filogenetyczna i wywoływanie SNP

SNP 28 kompletnych genomów wywołano przy użyciu potoku SaRTree 59 w stosunku do chromosomu 1 i chromosomu 2 szczepu V. cholerae O1 biovar El Tor N16961 (GCF_900205735.1) oddzielnie. Próg proporcji 100 został ustawiony do wywołania SNP i zidentyfikowano wszystkie rekombinowane SNP. SNP publicznie dostępnych genomów i kompletnych genomów w tym badaniu wywołano przy użyciu potoku SaRTree przy użyciu progu proporcji 20 i usunięto wszystkie rekombinowane SNP. Użyliśmy IQ-Tree (wersja 2.0.4) 60 z domyślnymi parametrami i 1000 ultraszybkich replikacji bootstrapowych 61 do skonstruowania drzewa maksymalnego prawdopodobieństwa (ML) przy użyciu SNP z obu chromosomów (najlepiej dopasowany model: TVMe+ASC [kompletne drzewo genomu] i TVMe+ASC + R2 [drzewo genomu NCBI]). Szczep C5 został użyty jako grupa zewnętrzna dla obu drzew. Pliki drzew zostały adnotowane i zwizualizowane w iTOL (wersja 6.5.2) 62 . SNP zostały zmapowane na gałęzie drzewa przez rurociąg SaRTree.
Użyte kategorie funkcjonalne zostały zdefiniowane przez Database of Clusters of Orthologous Genes (COGs) w NCBI (dane zaktualizowane: marzec 2022). Każdy gen genomów z tego badania został wyrównany z genomem referencyjnym, a znaczniki locus zostały użyte do powiązania kategorii funkcjonalnych. Należy zauważyć, że aby powiązać znaczniki locus genu GCF_900205735.1 z numerami VC używanymi w starych adnotacjach i wielu publikacjach, w tym w tym badaniu, dostarczyliśmy listę korespondencji dwóch adnotacji dla genów wymienionych w tym badaniu w Supplementary Data  11 .
Należy zauważyć, że przeprowadziliśmy analizę BEAST na kompletnym zestawie danych genomu i całym zestawie danych. Niestety, w przypadku kompletnego zestawu danych genomu analiza TempEst (wersja 1.5.3) wykazała, że ​​nie było wystarczającego sygnału czasowego, aby wykonać analizę BEAST. W przypadku całego zestawu danych szkiców genomów Illumina i kompletnych genomów łącznie, istniał dobry sygnał czasowy na podstawie analizy TempEst. Jednak było osiem genomów z bardzo długimi długościami gałęzi końcowych, co doprowadziło do naruszenia wszystkich modeli ewolucyjnych testowanych w analizie BEAST. Jednym z ośmiu genomów był szczep z Indonezji wyizolowany w 1961 r., który najwcześniej się rozszedł, więc przeprowadziliśmy analizę BEAST, 1) usuwając osiem genomów; 2) zachowując indonezyjski, ale usuwając pozostałe siedem genomów. W obu przypadkach, wymuszając szczep C5 (szczep sprzed pandemii) jako grupę zewnętrzną, szacunkowa data dla MCRA siódmej pandemii wynosiła lata 40. XX wieku. W szczególności w tym drugim przypadku efektywna wielkość próbki (ESS) dla częstotliwości zegara i ogólnych wartości a priori była bardzo niska.

Wielopoziomowe typowanie genomu

Wszystkie genomy w tym badaniu, w tym kompletne genomy i sekwencjonowane genomy Illumina, zostały przetworzone i przesłane do bazy danych V. cholerae MGT23 . MGT ST zostały przypisane automatycznie przez serwer MGTdb ( https://mgtdb.unsw.edu.au/vibrio/ ). MGT2 ST1, ST2 i ST3 odpowiadają odpowiednio siódmej fali pandemii 1, fali 2 i fali 323 .

Analiza elementów genetycznych

ABRicate ( https://github.com/tseemann/abricate ) (wersja 0.9.8) został użyty do przewidywania genów i plazmidów AMR w bazach danych ResFinder (w dniu 23/08/2021) 63 i PlasmidFinder 64 , odpowiednio. Użyliśmy AMRFinderPlus w wersji 3.12.8 z wersją bazy danych 2024-05-02.2, aby zidentyfikować mutacje punktowe w zespołach 65 . Obecność 67 genów wirulencji z CTXφ, VPI, VSP-I i VSP-II, T6SS, T3SS i RTX została również przeszukana przy użyciu ABRicate. Duplikacje zidentyfikowano przy użyciu nukleotydu BLAST (wersja 2.9.0+) z sekwencjami kodującymi siódmy szczep pandemiczny V. cholerae N16961 (numery akcesyjne RefSeq NC_002505.1 i NC_002506.1). Identyczność 99% została użyta jako punkt odcięcia dla przesiewu duplikacji.

Analiza superintegronów

Do identyfikacji SI wykorzystano sekwencje int I4 66 i 115 bp VCR. SI wyekstrahowano z 25 zamkniętych chromosomów. Oprogramowanie SnapGene (wersja 4.2.4) i progressiveMauve (wersja 2.4.0) 67 wykorzystano do wyrównania i analizy insercji i delecji w SI. Prokka (wersja 1.14.6) 68 wykorzystano do adnotacji genów w SI.

Przegrupowanie i wyrównanie genomu

Dwa chromosomy kompletnych genomów zostały uporządkowane osobno przy użyciu programu Circlator (wersja 1.5.5) 69 . W chromosomie 1, dnaA zostało użyte jako pozycja startowa do uporządkowania sekwencji, a w chromosomie 2, intI 4 zostało użyte do uporządkowania sekwencji. Uporządkowane chromosomy zostały wyrównane w programie progressiveMauve (wersja 2.4.0) 67 . Wykluczono cztery sekwencje chromosomu 2, które nie zostały w pełni zmontowane.

Podsumowanie raportu

Więcej informacji na temat projektu badawczego można znaleźć w  podsumowaniu sprawozdawczym Nature Portfolio Reporting Summary dostępnym pod tym artykułem.

Dostępność danych

Wszystkie 22 genomy zsekwencjonowane w tym badaniu zostały przesłane jako surowe odczyty pod numerem akcesyjnym BioProject PRJNA970070 w bazie danych NCBI SRA. Numery akcesyjne wszystkich innych publicznie dostępnych sekwencji użytych w tym badaniu są wymienione w Supplementary Data  10 .

Odniesienia

  1. Ali, M., Nelson, AR, Lopez, AL i Sack, DA Zaktualizowane globalne obciążenie cholerą w krajach endemicznych. PLoS Negl. Trop. Dis. 9 , e0003832 (2015).

    Artykuł PubMed PubMed Central Google Scholar

  2. Kanungo, S., Azman, AS, Ramamurthy, T., Deen, J. i Dutta, S. Cholera. Lancet 399 , 1429–1440 (2022).

    Artykuł PubMed Google Scholar

  3. Kaper, JB, Morris, JG Jr i Levine, MM Cholera. Clin. Microbiol Rev. 8 , 48–86 (1995).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  4. Robert, S. Raportuje o epidemii cholery, która szalała w całym Hindostanie i na półwyspie Indii od sierpnia 1817 r. Opublikowano za zgodą rządu. Med. Chir. J. 2 , 547–557 (1820).

  5. Weil, AA i Ryan, ET Cholera: najnowsze aktualizacje. Curr. Opin. Infect. Dis. 31 , 455–461 (2018).

    Artykuł PubMed Google Scholar

  6. Sack, DA, Sack, RB, Nair, GB i Siddique, AK Cholera. Lancet 363 , 223–233 (2004).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  7. Barua, D. w History of Cholera . (red. Barua, D., Greenough, WB). Cholera. 1–36 (Boston, MA, Springer US, 1992).

  8. Hu, D. i in. Geneza obecnej siódmej pandemii cholery. Proc. Natl Acad. Sci. USA 113 , E7730–E7739 (2016).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  9. Mutreja, A. i in. Dowody na kilka fal globalnej transmisji w siódmej pandemii cholery. Nature 477 , 462–465 (2011).

    Artykuł REKLAMY CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  10. Domman, D. i in. Zintegrowany pogląd na Vibrio cholerae w Ameryce. Science 358 , 789–793 (2017).

    Artykuł REKLAMY CAS PubMed Google Scholar

  11. Weill, FX i in. Historia genomiczna siódmej pandemii cholery w Afryce. Science 358 , 785–789 (2017).

    Artykuł REKLAMY CAS PubMed Google Scholar

  12. Bwire, G. i in. Charakterystyka molekularna Vibrio cholerae odpowiedzialnego za epidemie cholery w Ugandzie metodą PCR, MLVA i WGS. PLoS Negl. Trop. Dis. 12 , e0006492 (2018).

    Artykuł PubMed PubMed Central Google Scholar

  13. Weill, FX i in. Wgląd w genomiczną epidemię cholery w Jemenie w latach 2016–2017. Nature 565 , 230–233 (2019).

    Artykuł REKLAMY CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  14. Oprea, M. i in. Siódma pandemia cholery w Europie rozpatrywana ponownie przez genomikę mikrobiologiczną. Nat. Commun. 11 , 5347 (2020).

    Artykuł REKLAMY CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  15. Lam, C., Octavia, S., Reeves, P., Wang, L. i Lan, R. Ewolucja siódmej pandemii cholery i pochodzenie epidemii z 1991 r., Ameryka Łacińska. Emerg. Infect. Dis. 16 , 1130–1132 (2010).

    Artykuł PubMed PubMed Central Google Scholar

  16. Luo, Y. i in. Epidemiologia genomiczna Vibrio cholerae O139, prowincja Zhejiang, Chiny, 1994-2018. Emerg. Infect. Dis. 28 , 2253–2260 (2022).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  17. John, TJ i Jesudason, MV Rozprzestrzenianie się Vibrio cholerae O139 w Indiach. J. Infect. Dis. 171 , 759–760 (1995).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  18. Islam, MS, Alam, MJ i Khan, SI Występowanie i rozmieszczenie kulturowego Vibrio cholerae O1 w środowiskach wodnych Bangladeszu. Int J. Evol. Stud. 47 , 217–223 (1995).

    Google Scholar

  19. Alam, M. i in. Sezonowa cholera wywoływana przez Vibrio cholerae serogrupy O1 i O139 w przybrzeżnym środowisku wodnym Bangladeszu. Appl Environ. Microbiol 72 , 4096–4104 (2006).

    Artykuł REKLAMY CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  20. Alam, M. i in. Toksygenna bakteria Vibrio cholerae w środowisku wodnym Mathbaria, Bangladesz. Appl Environ. Microbiol 72 , 2849–2855 (2006).

    Artykuł REKLAMY CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  21. Ramamurthy, T. i in. Ponowne przyjrzenie się globalnej epidemiologii cholery w powiązaniu z genomiką Vibrio cholerae . Front. Public Health 7 , 203 (2019).

    Artykuł PubMed PubMed Central Google Scholar

  22. Monir, MM i in. Atrybuty genomiczne Vibrio cholerae O1 odpowiedzialne za masową epidemię cholery w Bangladeszu w 2022 r. Nat. Commun. 14 , 1154 (2023).

    Artykuł REKLAMY CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  23. Cheney, L., Payne, M., Kaur, S. i Lan, R. Wielopoziomowe typowanie genomu opisuje krótkoterminową i długoterminową epidemiologię molekularną Vibrio cholerae . mSystems 6 , e0013421 (2021).

    Artykuł PubMed Google Scholar

  24. Karaolis, DK i in. Wyspa patogeniczności Vibrio cholerae związana ze szczepami epidemicznymi i pandemicznymi. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95 , 3134–3139 (1998).

    Artykuł REKLAMY CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  25. Harmer, CJ & Hall, RM pRMH760, prekursor plazmidów A/C(2) niosących geny blaCMY i blaNDM. Micro. Drug Resist 20 , 416–423 (2014).

    Artykuł CAS Google Scholar

  26. Mukerjee, S. Problemy cholery (EL TOR). Am. J. Trop. Med. Hyg. 12 , 388–392 (1963).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  27. Felsenfeld, O. Kilka uwag na temat epidemii cholery (E1 Tor) w latach 1961–1962. Bull. World Health Organ 28 , 289–296 (1963).

    CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  28. Blake, PA i in. Cholera w Portugalii, 1974.I. sposoby transmisji. Am. J. Epidemiol. 105 , 337–343 (1977).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  29. Mey, AR, Butz, HA i Payne, SM Vibrio cholerae CsrA reguluje poziom ToxR w odpowiedzi na aminokwasy i jest niezbędny do wirulencji. mBio 6 , e01064 (2015).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  30. Milton, DL Wykrywanie kworum u wibrionów: złożoność dla dywersyfikacji. Int J. Med Microbiol 296 , 61–71 (2006).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  31. Chaparro, AP, Ali, SK i Klose, KE Chemoreceptory akceptujące grupy metylowe zależne od ToxT, AcfB i TcpI, przyczyniają się do kolonizacji jelit przez Vibrio cholerae . FEMS Microbiol Lett. 302 , 99–105 (2010).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  32. Conner, JG, Teschler, JK, Jones, CJ, Yildiz, FH Pozostać przy życiu: cykl przetrwania, transmisji i rozprzestrzeniania się Vibrio cholerae w środowisku. Microbiol. Spectr . 4 , 10 (2016).

  33. Jobling, MG i Holmes, RK Charakterystyka hapR , pozytywnego regulatora genu HA/proteazy Vibrio cholerae hap i jego identyfikacja jako funkcjonalnego homologu genu Vibrio harveyi luxR . Mol. Microbiol. 26 , 1023–1034 (1997).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  34. Rothenbacher, FP i Zhu, J. Skuteczne odpowiedzi na sygnały gospodarza i bakterii podczas kolonizacji Vibrio cholerae . Gut Microbes 5 , 120–128 (2014).

    Artykuł PubMed Google Scholar

  35. Hsiao, A. & Zhu, J. Patogeniczność i regulacja wirulencji Vibrio cholerae na styku interakcji gospodarza z mikrobiomem jelitowym. Virulence 11 , 1582–1599 (2020).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  36. Sengupta, N., Paul, K. i Chowdhury, R. Globalny regulator ArcA moduluje ekspresję czynników wirulencji u Vibrio cholerae . Infect. Immun. 71 , 5583–5589 (2003).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  37. Xi, D. i in. Regulator odpowiedzi ArcA wzmacnia formowanie biofilmu w sposób vpsT w warunkach beztlenowych u Vibrio cholerae . Micro. Pathog. 144 , 104197 (2020).

    Artykuł CAS Google Scholar

  38. Cheung, J. & Hendrickson, WA Struktury krystaliczne kompleksów ligandów C4-dikarboksylanowych z domenami sensorycznymi kinaz histydynowych DcuS i DctB. J. Biol. Chem. 283 , 30256–30265 (2008).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  39. Thomas, GH i Boyd, EF O transporcie i wykorzystaniu kwasu sialowego przez Vibrio cholerae . Mikrobiologia 157 , 3253–3254 (2011).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  40. Cheng, AT, Ottemann, KM i Yildiz, FH Regulator odpowiedzi na Vibrio cholerae VxrB kontroluje kolonizację i reguluje układ wydzielniczy typu VI. PLoS Pathog. 11 , e1004933 (2015).

    Artykuł PubMed PubMed Central Google Scholar

  41. Kitts, G. i in. Dwuskładnikowy system regulacyjny Rvv reguluje tworzenie się biofilmu i kolonizację w Vibrio cholerae . PLoS Pathog. 19 , e1011415 (2023).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  42. Didelot, X. i in. Rola Chin w globalnym rozprzestrzenianiu się obecnej pandemii cholery. PLoS Genet . 11 , e1005072 (2015).

    Artykuł PubMed PubMed Central Google Scholar

  43. Boyce, KJ Mutatory wzmacniają adaptacyjną mikroewolucję u patogennych mikrobów. Mikroorganizmy . 10 , 442 (2022).

  44. Glass, RI i in. Wielolekooporność przenoszona przez plazmidy u Vibrio cholerae serogrupy O1, biotyp El Tor: dowody na ognisko ogniska punktowego w Bangladeszu. J. Infect. Dis. 147 , 204–209 (1983).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  45. Dalsgaard, A., Forslund, A., Serichantalergs, O. & Sandvang, D. Dystrybucja i zawartość integronów klasy 1 w różnych szczepach Vibrio cholerae O-serotypu wyizolowanych w Tajlandii. Antimicrob. Agents Chemother. 44 , 1315–1321 (2000).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  46. Jaskolska, M., Adams, DW i Blokesch, M. Dwa systemy obronne eliminują plazmidy z siódmej pandemii Vibrio cholerae . Nature 604 , 323–329 (2022).

    Artykuł REKLAMY CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  47. Carraro, N., Rivard, N., Ceccarelli, D., Colwell, RR, Burrus, V. IncSpójne plazmidy A/C mobilizują nową rodzinę wysp oporności wielolekowej w klinicznych izolatach Vibrio cholerae non-O1/non-O139 z Haiti. mBio . 7 , e00509 (2016).

  48. Carraro, N., Matteau, D., Luo, P., Rodrigue, S. i Burrus, V. Główny aktywator koniugacyjnych plazmidów IncA/C stymuluje wyspy genomowe i rozprzestrzenianie się oporności wielolekowej. PLoS Genet. 10 , e1004714 (2014).

    Artykuł PubMed PubMed Central Google Scholar

  49. Kazama, H., Hamashima, H., Sasatsu, M. i Arai, T. Charakterystyka genu oporności na środki antyseptyczne qac E delta 1 wyizolowanego z klinicznych i środowiskowych izolatów Vibrio parahaemolyticus i Vibrio cholerae non-O1. FEMS Microbiol. Lett. 174 , 379–384 (1999).

    CAS PubMed Google Scholar

  50. Wang, R., Liu, H., Zhao, X., Li, J. & Wan, K. IncPlazmidy A/C nadające wysoką oporność na azytromycynę u Vibrio cholerae . Int J. Antimicrob. Agents 51 , 140–144 (2018).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  51. Wang, R. i in. IncPlazmidy A/C występujące w poważnych szczepach Vibrio cholerae serogrupy O139 opornych na wiele leków w Chinach. Int J. Antimicrob. Agents 45 , 249–254 (2015).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  52. Luo, Y. i in. Struktura populacji i oporność wielolekowa Vibrio cholerae non-O1/non-O139 w rzekach słodkowodnych w Zhejiang w Chinach. Micro. Ecol. 82 , 319–333 (2021).

    Artykuł REKLAMY CAS Google Scholar

  53. Orata, FD i in. Dynamika interakcji genetycznych między Vibrio metoecus i Vibrio cholerae , dwoma bliskimi krewnymi współwystępującymi w środowisku. Genome Biol. Evol. 7 , 2941–2954 (2015).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  54. Gao, Y. i in. Zmienność strukturalna superintegronu w toksynotwórczym Vibrio cholerae O1 EI Tor. Biomed. Environ. Sci. 24 , 579–592 (2011).

    CAS PubMed Google Scholar

  55. Boucher, Y. i in. Lokalne mobilne pule genów szybko przekraczają granice gatunkowe, powodując endemiczność w globalnych populacjach Vibrio cholerae . mBio 2 , e00335–10 (2011).

    Artykuł PubMed PubMed Central Google Scholar

  56. Waters, EV, Tucker, LA, Ahmed, JK, Wain, J. i Langridge, GC Wpływ przegrupowania genomu Salmonella na ekspresję genów. Evol. Lett. 6 , 426–437 (2022).

    Artykuł PubMed PubMed Central Google Scholar

  57. Koren, S. i in. Canu: skalowalny i dokładny montaż długich odczytów poprzez adaptacyjne ważenie k-merów i separację powtórzeń. Genome Res. 27 , 722–736 (2017).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  58. Wick, RR, Judd, LM, Gorrie, CL i Holt, KE Unicycler: Rozwiązywanie zespołów genomu bakteryjnego z krótkich i długich odczytów sekwencjonowania. PLoS Comput. Biol. 13 , e1005595 (2017).

    Artykuł REKLAMY PubMed PubMed Central Google Scholar

  59. Hu, D., Liu, B., Wang, L. i Reeves, PR Żywe drzewa: wysokiej jakości, powtarzalna i wielokrotnego użytku konstrukcja drzew filogenetycznych bakterii. Mol. Biol. Evol. 37 , 563–575 (2020).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  60. Minh, BQ i in. IQ-TREE 2: nowe modele i wydajne metody wnioskowania filogenetycznego w erze genomicznej. Mol. Biol. Evol. 37 , 1530–1534 (2020).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  61. Hoang, DT, Chernomor, O., von Haeseler, A., Minh, BQ & Vinh, LS UFBoot2: poprawa ultraszybkiego przybliżenia bootstrapowego. Mol. Biol. Evol. 35 , 518–522 (2018).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  62. Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v5: internetowe narzędzie do wyświetlania i adnotacji drzewa filogenetycznego. Nucleic Acids Res . 49 , W293–W296 (2021).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  63. Zankari, E. i in. Identyfikacja nabytych genów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. J. Antimicrob. Chemother. 67 , 2640–2644 (2012).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  64. Carattoli, A. i in. Wykrywanie in silico i typowanie plazmidów przy użyciu PlasmidFinder i typowanie sekwencji multilocus plazmidów. Antimicrob. Agents Chemother. 58 , 3895–3903 (2014).

    Artykuł PubMed PubMed Central Google Scholar

  65. Feldgarden, M. i in. AMRFinderPlus i Reference Gene Catalog ułatwiają badanie powiązań genomicznych między opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe, reakcją na stres i wirulencją. Sci. Rep. 11 , 12728 (2021).

    Artykuł REKLAMY CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  66. Zhang, C. i in. Trend oczyszczający w integronie chromosomowym w szczepach Vibrio cholerae podczas siódmej pandemii. Infect. Genet Evol. 26 , 241–249 (2014).

    Artykuł PubMed Google Scholar

  67. Darling, AC, Mau, B., Blattner, FR i Perna, NT Mauve: wielokrotne dopasowanie konserwatywnej sekwencji genomowej z przegrupowaniami. Genome Res. 14 , 1394–1403 (2004).

    Artykuł CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

  68. Seemann, T. Prokka: szybka adnotacja genomu prokariotycznego. Bioinformatics 30 , 2068–2069 (2014).

    Artykuł CAS PubMed Google Scholar

  69. Hunt, M. i in. Circlator: automatyczna cyrkularyzacja zespołów genomu przy użyciu długich odczytów sekwencjonowania. Genome Biol. 16 , 294 (2015).

    Artykuł PubMed PubMed Central Google Scholar

  70. Stutzmann, S. & Blokesch, M. Porównanie naturalnej transformacji wywołanej chityną w pandemii. Szczepy Vibrio cholerae O1 El Tor. Environ. Microb. 22 , 4149–4166 (2020).

Pobierz referencje

Podziękowanie

Yun Luo był doktorantem wspieranym przez Australian Government Research Training Program Scholarship. Badania te były częściowo wspierane przez grant National Health and Medical Council of Australia (2011806, RL). Autorzy dziękują Liamowi Cheneyowi za pomoc w sekwencjonowaniu.

  • Opublikowany:

Informacje o autorze

Autorzy i afiliacje

Wkłady

RL wymyślił badanie. YL przeprowadził eksperymenty i analizę danych oraz napisał szkic manuskryptu. MP, SD, SO i RL zweryfikowali podstawowe dane. MP, SK, SO i RL przejrzeli i zredagowali manuskrypt. Wszyscy autorzy przejrzeli i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu. Wszyscy autorzy mieli pełny dostęp do wszystkich danych w tym badaniu. RL miał ostateczną odpowiedzialność za decyzję o przesłaniu do publikacji.

Autor korespondencyjny

Korespondencja z Ruiting Lan .

Deklaracje etyczne

Konflikty interesów

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Recenzja ekspercka

Informacje o recenzji eksperckiej

Nature Communications dziękuje Oli Brynildsrud i Thandavarayan Ramamurthy, którzy wspólnie z Agilą Pragasam dokonali recenzji, za ich wkład w recenzję ekspercką tej pracy. Dostępny jest plik recenzji eksperckiej.

Informacje dodatkowe

Uwaga wydawcy: Springer Nature zachowuje neutralność w kwestii roszczeń jurysdykcyjnych na opublikowanych mapach i powiązań instytucjonalnych.

Informacje uzupełniające

Prawa i uprawnienia

Otwarty dostęp Niniejszy artykuł jest licencjonowany na podstawie licencji Creative Commons Uznanie autorstwa-Użycie niekomercyjne-Bez utworów zależnych 4.0 Międzynarodowe, która zezwala na wszelkie niekomercyjne wykorzystanie, udostępnianie, dystrybucję i reprodukcję w dowolnym medium lub formacie, pod warunkiem podania odpowiedniego uznania oryginalnym autorom i źródłu, podania linku do licencji Creative Commons i wskazania, czy zmodyfikowano licencjonowany materiał. Na mocy tej licencji nie masz pozwolenia na udostępnianie zaadaptowanego materiału pochodzącego z tego artykułu lub jego części. Obrazy lub inne materiały stron trzecich w tym artykule są objęte licencją Creative Commons artykułu, chyba że wskazano inaczej w linii kredytowej do materiału. Jeśli materiał nie jest objęty licencją Creative Commons artykułu, a zamierzone użycie nie jest dozwolone przez przepisy ustawowe lub przekracza dozwolone użycie, będziesz musiał uzyskać pozwolenie bezpośrednio od właściciela praw autorskich. Aby wyświetlić kopię tej licencji, odwiedź stronę http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ .

Przedruki i zezwolenia

O tym artykule

Sprawdź aktualizacje. Zweryfikuj walutę i autentyczność za pomocą CrossMark

Cytuj ten artykuł

Luo, Y., Payne, M., Kaur, S. i in. Genomiczne dowody dwuetapowej transmisji wczesnej siódmej pandemii cholery. Nat Commun 15 , 8504 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-52800-w

Link do artykułu: https://www.nature.com/articles/s41467-024-52800-w